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IMPACTO DEL EMPLEO DEL INTERFERON ALFA COMO REGULADOR DE LA EXPRESION DEL VIRUS PAPILOMA HUMANO EN EL CANCER CERVICO-UTERINO
Silvio E Perea,^1 Omar Lopez Ocejo,^1 Rolando Garcia Milian,^1 Manuel J Arana,^1 Pedro Lopez-Saura^1 y Maria de los Angeles Rios^2
^1 Departamento de Biologia Celular, Division de Farmaceuticos. Centro de
Ingenieria Genetica y Biotecnologia, apartado postal 6162, Ciudad de La
Habana.
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Introduccion El virus papiloma humano (VPH) perteneciente a la familia Papovaviridae, constituye un grupo heterogeneo de virus de ADN de doble cadena que infecta las celulas de la capa basal del epitelio y se replica y expresa en estrecha coordinacion con el programa de diferenciacion del mismo. Entre las lesiones mas comunes en humanos figuran la papilomatosis laringea, el condiloma acuminado y cervical, las verrugas vulgares y plantares, las displasias anogenitales y los carcinomas. En estudios epidemiologicos realizados por diferentes grupos en el mundo, ha sido posible la identificacion de la presencia del ADN viral en tumores de localizaciones que incluyen el cervix uterino, vulva, laringe, prostata y pulmon, entre otras. Asi, el VPH es considerado agente etiologico del cancer del tracto genital. El cancer cervical uterino es la segunda causa de muerte entre las mujeres de todo el mundo. Por ejemplo, en los Estados Unidos de America ocurren cada ano 13 000 nuevos casos de cancer de cervix y 4 500 muertes por esta enfermedad. En paises subdesarrollados como Mexico, Peru y otros de America Latina, estas neoplasias constituyen un gran problema de salud actual y se convierten en la primera causa de muerte entre mujeres por cancer. El desarrollo del cancer de origen epitelial a causa de la infeccion mantenida por VPH constituye un proceso que, despues de una larga latencia, pasa a un estadio pre-maligno, conocido como neoplasia intraepitelial en el cual se experimentan cambios fenotipicos de las celulas infectadas y, finalmente, la lesion evoluciona a carcinoma in situ. Durante muchos anos, el tratamiento convencional de cancer invasivo del cervix uterino ha sido llevado a cabo mediante cirugia, radiacion o ambas. La quimioterapia ha sido solo restringida a aquellos pacientes con enfermedad avanzada que no admiten ningun otro tratamiento. Recientemente, se han usado diferentes agentes en combinacion con la radioterapia en intentos de potenciar los efectos de las radiaciones y reducir la incidencia de recurrencias. De esta forma, se han reportado estudios de fase II usando mitomycin C y 5- fluorouracilo en combinacion con radiacion para el tratamiento del cancer de cervix uterino, asi como tambien la adriamicina y el bleomicin. Por su parte, en estudios de fase III, el efecto radiosensibilizador del cisplatino y la hidroxiurea, han sido tambien demostrados en el tratamiento de estas neoplasias. Sin embargo, no ha existido una evidencia clara que demuestre que la quimioterapia pudiera resultar beneficiosa en el mejoramiento de la calidad de vida e incremento de la sobrevida de pacientes con cancer de cervix. Asi, la carencia de un impacto de la quimioterapia en la sobrevida y las muertes anualmente producidas en todo el mundo en mujeres con cancer de cervix uterino, indican la necesidad urgente de una terapia mas efectiva para esta enfermedad. El interferon (IFN) alfa ha sido usado con eficacia en el tratamiento de enfermedades asociadas al VPH, como condiloma acuminado, neoplasia intraepitelial cervical y papilomatosis laringea. Sin embargo, los mecanismos celulares y moleculares por los cuales el IFN pudiera producir la regresion de las lesiones asociadas a los VPHs aun no han sido esclarecidos.
En el caso particular de la neoplasia intraepitelial cervical, el tratamiento con IFN ha sido introducido en la ultima decada. Aunque la terapeutica mas usada en la actualidad para este tipo de lesion asociada a la infeccion por VPH, consiste en la conizacion y la excision diatermica de la zona transformada. Otros metodos usados en el mundo para el tratamiento de estas entidades premalignas han sido la criocirugia y electrocirugia. Sin embargo, la mayor desventaja de los tratamientos que conllevan cirugia es que generalmente se requiere de personal especializado para su ejecucion y en ocasiones equipamientos caros. Ademas, implican la hospitalizacion del paciente, uso de anestesia y a veces de tales metodos que producen un sangramiento prolongado y trastornos en la fertilidad futura de la paciente debido a la incompetencia del utero o estenosis.
Los IFNs, desde su descubrimiento en 1957, han sido considerados como citocinas que ejercen funciones paracrinas, que incluyen el establecimiento de un estado antiviral mediante la supresion de la replicacion y/o expresion de diferentes virus, efecto antimitotico, e inmunomodulador.
Sobre la base de los antecedentes senalados, en este trabajo nos propusimos evaluar la efectividad del IFN alfa como regulador de la expresion genetica del VPH en el cancer cervico-uterino mediante el uso de aproximaciones de oncologia experimental, asi como la evaluacion en ensayos clinicos de eficacia.
Los objetivos fundamentales de este trabajo son:
2. Evaluar el efecto a corto plazo del IFN alfa sobre la expresion del VPH 18 en celulas HeLa, profundizando asi en el mecanismo molecular de regulacion de la expresion viral por la citocina.
3. Demostrar en un ensayo de eficacia el efecto in vivo de la terapia con IFN alfa sobre los niveles de expresion de algun tipo de VPH oncogenico en pacientes con cancer cervico-uterino invasivo asociado a estos virus.
4. Demostrar la eficacia del tratamiento del condiloma cervical con IFN alfa 2b topico.
Para el estudio del efecto del tratamiento prolongado con IFN alfa en cultivo, usando como modelo las celulas HeLa (adenocarcinoma cervico-uterino que expresan VPH 18), se analizaron diferentes parametros fenotipicos de la celula maligna al cabo de los 41 dias de tratamiento cronico con las preparaciones de IFN alfa leucocitario y alfa 2b recombinante. El analisis del parametro de tumorigenicidad se siguio hasta un ano despues del tratamiento. Expresion del VPH 18 y de la enzima 2'-5' oligoadenilato sintetasa (2-5 A) Los resultados de las experiencias de Northern Blots demostraron que ambas preparaciones de IFN alfa redujeron considerablemente los niveles de acido ribonucleico mensajero (ARNm) viral despues de 41 dias de tratamiento, con respecto a las celulas que solo recibieron medio de cultivo. El IFN alfa leucocitario fue mas selectivo que el IFN alfa 2b, en terminos de regulacion de la expresion viral. Paralelamente, se detectaron niveles incrementados de ARNm de la 2-5 A sintetasa en las celulas tratadas con IFN respecto a las no tratadas. Debido a que esta enzima ha sido considerada como un marcador de respuesta al IFN, su incremento en nuestras condiciones experimentales fue indicativo de una accion eficaz de ambas preparaciones de IFN en el modelo empleado. Clonogenicidad en medio semisolido y tumorigenicidad en ratones atimicos Entre los parametros asociados con el fenotipo tumoral, se determino la capacidad de las celulas expuestas al IFN de formar colonias en medio agar despues de los 2, 7 y 41 dias de tratamiento, asi como la capacidad de generar tumores en animales inmunosuprimidos a los 41 dias de exposicion de las celulas a los IFNs alfa. Los resultados indicaron que el tratamiento de las celulas HeLa durante 2 y 7 dias no modifico la clonogenicidad de estas, mientras que en el caso en que el tratamiento con ambas preparaciones de IFN alfa fue prolongado hasta 41 dias, se observo una reduccion significativa del numero de colonias formadas en el medio agar. Estas evidencias denotaron que este rasgo fenotipico de la celula maligna es modificado por el tratamiento a largo plazo con IFN y que, ademas, es posterior a la inhibicion del virus por la citocina. Estudios morfologicos Se realizo una tincion con hematoxilina-eosina para evaluar cambios morfologicos y se determino el indice mitotico como rasgo particular del fenotipo maligno de las celulas. Los resultados experimentales demostraron una reduccion del indice mitotico en las celulas tratadas con ambas preparaciones de INF respecto a las celulas controles. Adicionalmente, se observaron cambios fenotipicos notables inducidos por el tratamiento durante 41 dias con IFNs alfa, los cuales incluyeron la disminucion del pleomorfismo celular y de celulas gigantes multinucleadas (Figura 1). Ambos parametros demuestran cambios fenotipicos inducidos por la exposicion cronica de estas celulas a los IFNs alfa.
Debido a que las celulas expuestas durante 41 dias con IFNs alfa no produjeron modificacion en la capacidad de generar tumores en animales atimicos, este ensayo se reintento despues de haber tratado las celulas cronicamente con IFN durante un ano. Los resultados de estas experiencias demostraron que las celulas expuestas durante ese tiempo perdieron la capacidad tomorigenica (Tabla 1). Asi, en estas condiciones, parecen modificarse otros parametros claves relacionados con el fenotipo tumorigenico de la celula, los cuales no fueron cambiados previamente durante el tratamiento. Tabla 1. Tumorigenicidad de celulas HeLa tratadas con IFNs alfa durante un ano.
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Tratamiento Control IFN alfa 2b IFN leucocitario
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Prendimiento / Total 6/10 0/10 0/10
% 60 0 0
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Mecanismo molecular de regulacion del VPH 18 por IFN alfa Se investigaron los posibles blancos moleculares del VPH 18 que pudieran ser sensibles a los efectos del IFN alfa. Para ello se uso el mismo modelo de celulas HeLa y el tratamiento con IFN alfa 2b a corto plazo. Modulacion de los niveles de ARNm del VPH 16 mediada por la terapia con IFN alfa en pacientes con caracter cervico-uterino Sobre la base de nuestros hallazgos in vitro, el objetivo inmediato fue investigar si la terapeutica con IFN alfa era capaz de modular los niveles de expresion de ARNm de tipos oncogenicos de VPH in vivo. Para esta finalidad, se realizo un ensayo piloto en colaboracion con el Instituto Nacional de Oncologia y Radiobiologia (Ciudad de La Habana), en el cual solo se pretendio evaluar la eficacia de la terapia con IFN alfa en un numero reducido de pacientes con carcinoma cervical en terminos de regulacion de la expresion genetica del virus. Analisis de niveles de ARNm del VPH 16 en pacientes con carcinoma cervical tratados con IFN alfa
En estos estudios, el analisis molecular se realizo a partir de ADN o ARN total obtenido de biopsias de tumores de tres pacientes, tanto al inicio como al final del esquema de tratamiento con IFN alfa. La presencia de ADN de VPH 16 fue primeramente investigada mediante reaccion en cadena de la polimerasa, empleando sondas especificas complementarias a regiones del gen E7 del VPH 16. Los resultados de este analisis mostraron que las biopsias de los tres pacientes contenian secuencias de ADN correspondientes al VPH 16, lo cual esta en correspondencia con numerosos reportes epidemiologicos previamente publicados en los cuales se le atribuye a este tipo de virus un importante papel en el desarrollo del carcinoma epitelial.
Conjuntamente con la verificacion de la presencia de ADN viral, se analizo el patron de transcripcion de IFN alfa sobre los niveles de ARNm viral. El hecho mas impactante de estas experiencias lo constituyo la reduccion selectiva de los niveles de ARNm del VPH 16 por el tratamiento con IFN. Este efecto, en terminos cuantitativos, represento 67 % de la reduccion de la expresion viral en el paciente FMG y un 44 % en el paciente CCB (Figura 2). Hasta donde alcanza nuestro conocimiento, no existen reportes previos que indiquen un efecto inhibitorio del IFN alfa sobre los niveles de expresion VPH oncogenicos en tumores de pacientes asociados a tales virus.
Discusion En este trabajo hemos estudiado las acciones producidas por las preparaciones de IFN alfa leucocitario y de origen recombinante sobre celulas de adenocarcinoma de utero humano (HeLa) expuestas cronicamente a estas citocinas. Anteriormente, se habia reportado que el VPH 18 se encuentra integrado en el genoma de las celulas HeLa a razon de 20 copias por genoma celular y que expresa ARNm correspondiente a las oncoproteinas E6/E7/E1. En nuestras experiencias de Northern Blots, observamos que los IFNs alfa redujeron considerablemente los niveles de ARNm viral desde las 48 horas de incubacion y este efecto fue mantenido a lo largo del estudio. El hecho de que la preparacion de IFN alfa leucocitario fuese mas eficaz en el efecto inhibitorio sobre la expresion del virus puede deberse a la presencia de los diferentes subtipos de la familia de los IFNs alfa previamente descritos en esta preparacion de origen natural y que pudieran cooperar en ese sentido. El hecho de que los cambios fenotipicos se produjeran con posterioridad al evento de inhibicion de la expresion viral, es indicativo de que dicha regulacion es primaria en el proceso de reversion fenotipica inducida por IFN en estas celulas y, ademas, es un evento necesario, pero no suficiente.
Teniendo en cuenta que, despues del tratamiento cronico con IFNs alfa, las celulas HeLa solo experimentaron una reversion parcial del fenotipo maligno a los 41 dias, nosotros continuamos el tratamiento con la citocina en cultivo y analizamos la capacidad tumorigenica al cabo de un ano de tratamiento cronico. De manera espectacular, no hubo aparicion de masa tumoral en los animales inoculados con las celulas expuestas durante un ano a ambas preparaciones de IFN alfa. Asi, se puede concluir que, bajo estas condiciones experimentales, dicha citocina indujo un fenotipo no tumorigenico, probablemente mediante la modulacion en el tiempo de otros parametros relacionados con la tumorigenicidad.
De forma general, el proceso de reversion fenotipica inducida por IFN alfa es un proceso sequencial de multiples eventos, donde la inhibicion del VPH parece ser uno de los eventos moleculares iniciales.
En el modelo de las celulas HeLa, el IFN alfa parece regular los niveles de VPH 18 a traves de la represion de los transcriptos virales nacientes, probablemente mediante la represion de promotores celulares mas que de promotores virales. Ademas, parece existir un segundo nivel de control de la maquinaria transcripcional viral por IFN a traves del splicing. Sin embargo, se deben abordar, en el futuro proximo experiencias adicionales para la confirmacion definitiva de este otro nivel de regulacion de la expresion viral por IFN.
Los resultados presentados en este trabajo indican que el tratamiento con IFN alfa modula los niveles de expresion del VPH en pacientes con cancer cervical invasivo asociado con estos virus oncogenicos y asi pudiera ser un pre- requisito para la regresion del tumor por la terapia con esta citocina. Sin embargo, debido a que este estudio piloto solo pretendio evaluar la eficacia del IFN en un numero reducido de pacientes en cuanto a los niveles de ARNm viral, se impone la realizacion de ensayos clinicos de mayor envergadura con el objetivo de confirmar nuestros hallazgos.
Finalmente, las evidencias observadas en esta parte del trabajo, constituyen un elemento de originalidad desde el punto de vista de la primacia y de la perspectiva del empleo del IFN alfa en el cancer invasivo cervical, en combinacion con otras biomoleculas que modulen la expresion viral y/o estimulen la respuesta inmune especifica del tumor. Copyright 1997 Elfos Scientiae The following images related to this document are available:Line drawing images[ba97045b.gif] [ba97045a.gif] |
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