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Biotecnologia Aplicada
Elfos Scientiae
ISSN: 0684-4551
Vol. 14, Num. 3, 1997, pp. 204-207
Biotecnologia Aplicada 1997 Volume 14 No. 3, pp. 204-207

MENINGOENCEFALITIS VIRAL POR ENTEROVIRUS EN EL PERIODO DE 1990-1995

Pedro Mas Lago, Marite Bello, Rosa Palomera, Luis Morier, Ivonne valos, Belsy Acosta, Nevis Amin, Judith Cartaya y Luis Sarmiento

Departamento de Virologia, Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kouri" (IPK), apartado postal 601, Marianao 13, Ciudad de La Habana, Cuba.
E- mail: ciipk@ipk.sld.cu


Code Number:BA97047
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Introduccion

La Meningoencefalitis viral (MEV) es un sindrome multietiologico. Virus que difieren ampliamente en su morfologia, composicion quimica y replicacion pueden producir iguales cuadros clinicos, con lesiones histopatologicas identicas en el sistema nervioso central (SNC).

Los enterovirus, pertenecientes a la familia Picornaviridae son los agentes etiologicos mas comunes de las MEV (1, 2). Los enterovirus no polio (Coxsackievirus, Echovirus y los enterovirus del 68 al 71) han sido mas estudiados como agentes productores de MEV, desde el efectivo control de los Poliovirus, debido a la introduccion de las vacunas.

Los brotes epidemicos suceden en nuestro pais con una periodicidad de 4 anos. Los records historicos de reportes de MEV en Cuba han sido en 1985-86 (epidemia de Echovirus 4) y en 1994 (epidemia de Echovirus 30) (3).

Teniendo en cuenta la frecuencia de las MEV en nuestro medio y en el mundo, y conociendo que constituyen un problema de salud importante, sobre todo en la edad pediatrica (4), nos dimos a la tarea de realizar un estudio de la etiologia de este sindrome.

En el presente trabajo se hace una recopilacion de los estudios virologicos realizados en el Laboratorio de Enterovirus del Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kouri" (IPK, Ciudad de La Habana), en muestras de pacientes diagnosticados clinicamente con MEV en el periodo de 1990-1995, trazandonos como objetivos: brindar datos que permitan un mejor conocimiento de la participacion de los enterovirus como agentes etiologicos de las MEV en nuestro medio, mostrar el predominio de aislamiento de diferentes tipos de enterovirus en casos MEV en el periodo de 1990-1995 y relacionarlo con la tasa de incidencia de MEV, describir los resultados virologicos encontrados en las epidemias durante este periodo y valorar el uso de los sueros pares en el diagnostico de MEV por enterovirus.

Materiales y Metodos

Muestras

En el periodo de 1990 a 1995 se recibieron en el Laboratorio de Enterovirus del IPK 586 muestras de heces fecales (HF), 108 liquidos cefalorraquideos (LCR) y 1 095 sueros pareados, para un total de 1 789 muestras pertenecientes a 1 458 casos diagnosticados clinicamente como MEV.

Procesamiento de las muestras (5)

Las muestras se tomaron en condiciones esteriles y se trasladaron al laboratorio en frio o congeladas, conservandose a -20 C hasta el momento de su tratamiento.

De las HF, se realizo una suspension al 10 % en Solucion Tamponada de Fosfato (STF) y se centrifugo a 13 000 rpm durante 10 min El sobrenadante se tratocon cloroformo, se centrifugo en las mismas condiciones anteriores y se leanadio antibioticos (Penicilina y Estreptomocina en concentracion final de 1 000 U y 1 000 ul/mL, respectivamente). Los LCR se inocularon sin tratamiento previo. Los sueros se diluyeron 1/10, se trataron con cloroformo y se centrifugaron a 13 000 rpm durante 10 min. El sobrenadante se decanto para su utilizacion en la prueba de neutralizacion (Nt).

Inoculacion en los cultivos celulares (5)

Para el estudio de las HF y LCR se usaron 2 sistemas celulares:

    1. Celulas de linea de rinon de mono verde africano adulto normal Cercopithecus aetiops (Vero), en el rango de 130-145 pases.

    2. Celulas diploides de fibroblastos de pulmon embrionario humano (PHuE-1) en el rango de 17-21 pases.

Las muestras se inocularon por duplicado (200 uL por tubo) en los tubos de cultivo de los sistemas celulares anteriores, previo cambio del medio de crecimiento (con 10 % de suero de bovino fetal), por el del medio de mantenimiento (con 2 % de suero de bovino fetal). Los cultivos se incubaron a 37 C, observandose al microscopio diariamente durante 5 dias. Los tubos que mostraron efecto citopatogenico, caracteristico de enterovirus (ECP), se congelaron a -70 C y se les dio 2 pases mas; si se mantuvo el ECP, se congelo nuevamente para realizar la identificacion. Se consideraron negativas las muestras que no dieron ECP despues de 3 pases ciegos con 5 dias de observacion cada uno.

Identificacion viral

Los aislamientos con ECP, caracteristicos de la infeccion enteroviral, se identificaron por Nt (micrometodo), previamente determinados los 100 TCD50 de los virus aislados (5). La identificacion se realizo con mezclas de sueros equinos hiperinmunes a enterovirus, segun el esquema de Lim Benyesh-Melnick (LBM) que permite identificar 42 serotipos diferentes.

Determinacion de anticuerpos neutralizantes (Ac Nt)

Los sueros pareados obtenidos se investigaron por Nt (micrometodo) del ECP en celulas Vero (5). Los virus utilizados fueron: Echovirus 4, 6, 9, 11 y 30; Coxsackievirus A9, A16, B1, B2, B3, B4, B5 y B6, mantenidos en pases sucesivos en lineas celulares susceptibles y conservados a -70 C.

Se anadio a la placa de 96 pocillos y fondo plano 25 uL de medio 199 a partir de la 2da hasta la 6ta fila. Se realizaron diluciones de los sueros partiendo de 1:10 a 1:320. Se anadio 25 uL de la dilucion del virus que contiene 100 TCD50, previamente determinado. Se hicieron controles de la dosis del virus, control de suero y control de celulas. Se agito e incubo a 37 C en atmosfera de CO2 al 4 % durante 2-4 h. Posteriormente, se anadio a toda la placa 150 uL de suspension de celulas Vero en una concentracion de 200 000 cel/mL. Se agito e incubo a 37 C en atmosfera de CO2 al 4 %. La lectura se realizo en microscopio invertido a los 5 dias, cuando el control viral mostro un ECP que revelaba los 100 TCD50 del virus utilizado en la prueba.

Criterio de positividad: se considero como positivo la seroconversion, el incremento de 4 o mas diluciones del 2do suero con respecto al 1ro y los titulos altos en ambos sueros (1:80 o mas) frente al virus identificado como agente causal de un brote.

Analisis estadistico

El analisis estadistico se realizo por las Prueba de Kolmogorov-Smirnov y Prueba de Diferencias Significativas, para p < 0,01 en ambas casos.

Resultados y Discusion

La positividad de las muestras recibidas para aislamiento (HF y LCR) se observa en la Tabla 1. Se investigaron 694 muestras: 586 HF y 108 LCR, de las cuales fueron positivas a enterovirus 217 HF (37,03 %) y solo 8 LCR (7,40 %), y de estos, 3 fueron positivos tambien en HF. En total, se realizaron 225 aislamientos para un 32,42 %. El ano en que mas aislamientos se obtuvo fue 1994. Se encontro un mayor porcentaje de aislamientos en HF que en LCR (p < 0,01), comprobandose que las HF son mas productivas con fines de aislamiento (5).

Tabla 1. Muestras recibidas para aislamiento y positividad en el periodo estudiado (1990-1995).

------------------------------------------------------------
Ano      HF    HF Pos (%)    LCR    LCR Pos (%)    Total 
------------------------------------------------------------
1990    112    38(33,92)     10     0(0)            38
1991    176    50(28,40)      5     0(0)            50
1992     66    8(12,12)       2     0(0)             8
1993     60    12(20,0)      47     0(0)            12
1994    118    87(73,72)     31     8(25,80)        95
1995     54    22(40,74)     13     0(0)            22
Total   586    217(37,03)   108     8(7,40)     225(32,42 %)
------------------------------------------------------------
Fuente: Laboratorio de Enterovirus.

En 1990-91 se produjo un brote epidemico de MEV en la poblacion infantil de nuestro pais, en el cual se identifica como agente etiologico el Coxsackie A9 que estuvo circulando esos 2 anos. Ya en 1992, el Coxsackievirus A9 fue desplazado por el Coxsackie B4 pero en 1993 volvio a circular. Esta circulacion en "oleadas" es caracteristica de los enterovirus (6). Al inicio de 1994 se observaron las primeras evidencias de positividad a Echovirus 30, dando lugar a un brote epidemico de MEV de gran difusion, y su circulacion se mantuvo hasta fines de ano. En Octubre de 1995 comenzo un incremento vertical y acelerado en la notificacion de casos de MEV con respecto a similar periodo de 1994, detectandose que el agente causal fue el Coxsackievirus B5, el cual no circulaba desde 1976 (3).

En el periodo estudiado, se produjeron 3 brotes epidemicos de MEV por: Coxsackievirus A9 (1990-91), Echovirus 30 (1994) y Coxsackievirus B5 (1995). Otros autores han reportado estos agentes como causantes de brotes de MEV en sus paises.

El Coxsackievirus A9 fue reportado en Estados Unidos (7) y en Sudafrica (8). El Echovirus 30 fue el principal agente causal de MEV en Estados Unidos entre 1965-70 (7). Tambien fue aislado en 1990 en un brote en ninos menores de 1 ano. En Australia, Canada y paises asiaticos habia sido reportado por varios autores (9). El Coxackievirus B5 fue el principal responsable de MEV en Estados Unidos entre 1970-79.

La Tabla 2 refleja la positividad de las muestras de HF y LCR en cada sistema celular estudiado. Como ya mencionamos, en las HF se encontro el mayor numero de aislamientos: 36 en Vero, 124 en PHuE-1 y 57 en ambos cultivos; sin embargo, los 8 aislamientos obtenidos en LCR fueron solo en PHuE-1.

Tabla 2. Positividad de HF y LCR de casos de MEV en 2 sistemas celulares durante el periodo estudiado (1990-1995).

---------------------------------------------------------------------------


         No. muestras     Vero         PHuE-1     Vero/PHuE -1   Total (%)
        -------------  -----------  ------------  ------------
Muestra                Pos    (%)    Pos    (%)    Pos    (%)    
---------------------------------------------------------------------------

HF         586         36    6,14    124    21,16   57    9,72  217(37,03)
LCR        108          0    0         8    7,4      0    0       8(7,4)
Total      694         36    5,18    132    19,02   57    8,21  225(32,42)
---------------------------------------------------------------------------

Fuente: Laboratorio de Enterovirus.

De los sistemas celulares, el PHuE-1 resulto ser el mas sensible para los enterovirus en los anos estudiados, ya que se obtuvo mayor numero de aislamientos en el (p < 0,01).

Una posible explicacion de la mayor positividad en celulas PHuE-1, la constituye el hecho de que el Coxsackievirus A9 predomino en 3 de los 6 anos estudiados, y las celulas anteriormente mencionadas constituyen un sistema muy sensible para este agente. El cambio de la situacion epidemiologica podria hacer variar este patron de susceptibilidad, ya que hay enterovirus que tienen mas afinidad por uno u otro sistema celular.

Estudios realizados en otros paises coinciden con nuestros resultados. En 1987, Wildin (10) en Estados Unidos y Kinnunen y colaboradores (11) en Finlandia, y en 1994, Cobos y colaboradores (12) en Espana, estudiaron casos aislados y brotes de MEV, encontrando mayor numero de aislamientos de enterovirus en HF y en celulas de fibroblastos humanos. Estos resultados coinciden con los nuestros.

En 1991, se observa un ligero incremento de las tasas a 45,98 con respecto a 1990, que se relaciona con el predominio de Coxsackievirus A9 con 24 (480 %) de los 50 aislamientos de ese ano (Tabla 3). En 1992 y 1993 las tasas permanecen mas bajas al igual que el porcentaje de aislamientos (1,90 % y 8,51 %, respectivamente). Un incremento brusco de la tasa se produce en 1994 (85,62) y el porcentaje total de aislamientos fue de 37,25 %, siendo el Echovirus 30 el enterovirus predominante con 40 (42,10 %) del total de aislamientos. En 1995 se mantienen las tasas elevadas en un 70,63, siendo el Coxsackievirus B5 el enterovirus predominante con 81,81 % del total de aislamientos.

Tabla 3. Tasa de casos de MEV y circulacion de enterovirus segun los anos 1990-1995.

---------------------------------------------------------------------------
Ano    Tasa*    Total de casos    Total de     Enterovirus     Otros        
                  estudiados    aislamientos  predominante   enterovirus
---------------------------------------------------------------------------
1990   36,01         197        38 (19,28 %)     Cox A9      Cox A16, B1
                                              28 (73,68 %)    
1991   45,98         374        50 (13,36 %)     Cox A9      Echo 6, 7, 11, 
                                              24 (48,0 %)      14, 25
1992   36,64         421         8 (1,90 %)      Cox B4      Echo 15
                                               4 (50 %)
1993   32,50         141        12 (8,5 %)       Cox A9      Echo 15, 21,25
                                               4 (33,33 %)
1994   85,62         255        95 (37,25 %)     Echo 30     Echo 6, Cox A9
                                              40 (42,10 %)
1995   70,63          70        22 (31,42 %)     Cox B5      Cox B1, Echo   
                                              18 (81,81 %)   30, 32, EV no
                                                               Polio
---------------------------------------------------------------------------
*Por 100 000 habitantes.
EV: Enterovirus.
Fuente: Laboratorio de Enterovirus.

La Tabla 4 muestra la positividad de sueros pareados en casos de MEV frente a 13 enterovirus. De los 1 095 sueros pares investigados, fueron positivos a un solo virus 292, y 440 a mas de un virus, para un total de 732 que representa el 66,84 % del total.

Tabla 4. Positividad de sueros pareados mediante la tecnica de neutralizacion en casos de MEV en el periodo de 1990-1995.

---------------------------------------------------------------------------
                           Positivos a solo un virus
---------------------------------------------------------------------------
Ano   SP  Pos  E4  E6  E9  E11 E30 B1  B2  B3  B4  B5  B6  A9  A16 Pos* Tot 
     Inv  Tot                                                          (%)
---------------------------------------------------------------------------
1990   174 46   9  14   4   8   -   1   -   6   -   -   -   3   1  113 91,3
1991   279 79   6  33   8  11   -   -   -   4   2   -   3  12   -  143 79,5
1992   376 87   4  55   4  12   -   -   -   -   12  -   -   -   -  139 60,1
1993    44  9   -   5   -   3   -   -   -   -   -   -   1   -   -   24 75
1994   185 59   1  44   1   7   6   -   -   -   -   -   -   -   -   11 37,8
1995    37 12   -   2   -   -   -   -   -   1   -   9   -   -   -   10 59,4
Total 1095 292  20 153 17  41   6   1   -   11   14  9   4  15  1  440 66,8
---------------------------------------------------------------------------
Fuente: Laboratorio de Enterovirus.
* Positivos a mas de un virus.
S P Inv: Sueros pares investigados.
E: Echovirus.
B: Coxsackie B.
A: Coxsackie A.

El porcentaje de positividad por serologia (66,84 %) fue superior al detectado por aislamiento (32,42 %). En total, la positividad por aislamiento y serologia sobrepasa el 80 %, lo que evidencia la importancia de los enterovirus como agentes causantes de MEV en nuestro medio, coincidiendo con lo reportado en muchas partes del mundo (13).

El hecho de que se hayan encontrado mas sueros positivos a mas de un virus puede deberse a que, ante una infeccion o reinfeccion, se produce una respuesta anamnesica a un virus relacionado antigenicamente o a reacciones cruzadas. Los sueros pares son dificiles de interpretar en el diagnostico de enterovirus debido a la multiplicidad de serotipos, reacciones cruzadas y reacciones anamnesicas (6).

Entre 1990 y 1993 no se detecto ningun suero positivo a Echovirus 30; lo mismo sucedio desde 1990 a 1994 con el Coxsackievirus B5, por lo cual, al parecer, habia una poblacion susceptible a estos virus, lo que pudo influir en que se desarrollaran los brotes de MEV por Echovirus 30 (1994) y Coxsackievirus B5 (1995).

Miwa y Watanabe en 1990 (14) realizaron un estudio serologico en una epidemia de MEV en Japon, encontrandose un aumento significativo de Ac Nt contra 4 tipos de virus aislados y el 20 % de los pacientes tenian aumento en el titulo contra 2 o mas enterovirus. Durante otra epidemia de MEV por Echovirus 30, se realizo un estudio serologico encontrandose 51,9 % de positivos con la cepa prototipo y 34 % con la cepa aislada (15). En un estudio serologico hecho por Nt a 356 sueros pares de pacientes con MEV en Checoslovaquia, se encontro seroconversion en 87 (24,2 %) (16).

En los 6 anos de estudio de las MEV en Cuba podemos concluir que en el periodo de 1990-95 se encontraron 3 enterovirus causantes de brotes epidemicos: Coxsackievirus A9, Echovirus 30 y Coxsackievirus B5, correspondiendo en los casos de Echovirus 30 y Coxsackievirus B5 a elevadas tasas de incidencia. Ademas, se vincula por primera vez desde 1970 los Coxsackievirus A9 y Echovirus 30 como productores de MEV en Cuba.

References

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