Biotecnologia Aplicada Elfos Scientiae ISSN: 0684-4551 Vol. 14, Num. 3, 1997, pp. 208-209

MICROPURIFICACION DE BIOMOLECULAS ACTIVAS

Eugenio Hardy, Carlos Fernandez-Patron, Lila Castellanos-Serra, Elder Pupo y Angela Sosa

Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia. Apartado postal 6162, La Habana 6, Cuba.
E-mail: protchem@serverdos.cigb.edu.cu

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Introduccion

Entre las mas potentes tecnicas analiticas y preparativas de biomoleculas se encuentran las basadas en la electroforesis de alta resolucion en geles de agarosa o de poliacrilamida. Una vez efectuada la separacion en un gel, las biomoleculas deben ser detectadas, de preferencia por metodos que conserven la integridad quimica, permitan altos recobrados y no interfieran con la actividad biologica. Tales tecnicas deben ser simples, rapidas y aplicables a una amplia variedad de biomoleculas. Sin embargo, la mayoria de las tecnicas actuales de deteccion no cumplen con todos estos requisitos de modo simultaneo. En adicion, en el caso especifico de las proteinas, aunque hoy en dia es posible secuenciarlas y caracterizarlas a niveles picomolares (1) no existe un metodo de deteccion que permita estudiar la actividad biologica cuando solo se dispone de muy pequenas cantidades (p. ej., 1-5 picomoles) de material.

Nuestro grupo ha desarrollado un conjunto de tecnicas que satisfacen los requerimientos mencionados anteriormente. Estas tecnicas utilizan las sales de zinc e imidazol para la deteccion no destructiva y el recobrado cuantitativo de acidos nucleicos, lipopolisacaridos (LPS) / lipooligosacaridos (LOS) y proteinas.

Resultados y Discusion

Deteccion de acidos nucleicos intactos

Las sales de zinc e imidazol permiten detectar a los acidos nucleicos en geles de poliacrilamida (3,5-20 %) como bandas transparentes (negativas) e incoloras, claramente visibles sobre el fondo del gel que aparece de color blanco, debido a la precipitacion abundante del imidazolato de zinc (2). La sensibilidad del metodo es de 5-10 ng de ADN (0,1-6 kpb)/banda. Despues de ser detectado, el ADN se^ puede eluir del gel, con alta eficiencia (85 % o mas), mediante tecnicas convencionales. Nosotros hemos demostrado que este tipo de tincion no causa modificaciones al ADN: cuando se reemplaza la deteccion estandar con bromuro de etidio seguido de iluminacion a 302 nm (UV) por la nueva deteccion con zinc-imidazol, la frecuencia de transformacion (colonias/ug de ADN) obtenida con fragmentos de ADN purificados electroforeticamente aumenta al menos 10 veces (2, 3). Tambien hemos descrito (3) un procedimiento nuevo para la visualizacion sensible de acidos nucleicos intactos en geles de agarosa.

Deteccion de LPS/LOS en geles de poliacrilamida

Los LPS/LOS se pueden detectar en los geles de poliacrilamida con zinc- imidazol como tipicas bandas de tincion negativa (4). La sensibilidad del metodo con los lipopolisacaridos rugosos de N. meningitidis, Pseudomonas aeruginosa y B. pertussis, o los lisos de E. coli (cepas 0111:B4 y K-235) y S. tiphimurium, en geles de poliacrilamida de 1 mm de ancho, es de 1-5ng/banda. Estos valores son comparables a los obtenidos con el metodo convencional de plata (5). Al igual que los acidos nucleicos, los LPS/LOS detectados con zinc-imidazol permanecen biologicamente activos. Esta es la primera tincion de LPS/LOS compatible con la determinacion de su actividad biologica, y le confiere al metodo una ventaja considerable sobre la tincion con plata (5).

Un nuevo procedimiento de recobrado de proteinas en solucion

El procedimiento (6, 7) consiste en la generacion de particulas de gel de 32 um mediante una jeringuilla (1 mL) de polipropileno que contiene dos membranas metalicas de 100 y 32 um insertadas en su fondo. Las proteinas se eluyen por difusion pasiva, en 10 minutos con rendimientos del 85 % o en 20 minutos, con rendimientos de 91-98 % (en dependencia de su peso molecular), en un volumen minimo de tampon (p. ej., de 100-150 uL para una banda que contenga 100 pMol de BSA). Con este procedimiento, pudimos demostrar y cuantificar el efecto de la reduccion de las proteinas, antes de su separacion por electroforesis, sobre la eficiencia de la elucion. El procedimiento no requiere de equipamiento sofisticado y tiene notables ventajas sobre los metodos de electroelucion convencional, principalmente cuando se dispone de cantidades picomolares de proteina.

Aplicacion a la concentracion en solucion y la secuenciacion de proteinas poco abundantes

Se demostro la aplicacion de este procedimiento de elucion a la purificacion de nuevas proteinas naturales (6, 7). Ademas se desarrollo un nuevo procedimiento cromatografico para aplicar volumenes relativamente grandes de solucion (5-10 mL) a las membranas utilizadas para secuenciacion automatica de proteinas. Con las tecnicas existentes normalmente no es posible aplicar volumenes superiores a unas decenas de microlitros (1). Con este procedimiento es posible aplicar un volumen que va de pocos microlitros a varios mililitros lo que permite concentrar sobre una membrana grandes volumenes de soluciones muy diluidas de proteina hasta acumular una cantidad suficiente de material para obtener una secuencia clara.

Recobrado en solucion de proteinas biologicamente activas

Las proteinas separadas en geles que contienen SDS (la tecnica mas comun de electroforesis) se desnaturalizan y pierden su actividad biologica. Recientemente hemos informado (8) un procedimiento que permite renaturalizar (ganar la actividad biologica) con Triton X-100 las proteinas dentro del gel de electroforesis, despues de ser detectadas con imidazol-SDS-zinc (9) y a continuacion, mediante la aplicacion del nuevo procedimiento de elucion (6, 7), recuperarlas rapidamente en solucion y determinar su actividad biologica.

Los valores de actividad especifica (UI/mg de proteina) recuperados con este procedimiento para tres proteinas recombinantes/estandar de muestras puras fueron: 4,19 x 10^4 / 5,35 x 10^4 (estreptocinasa), 1,1 x 10^8 / 2,3 x 10^8 (interferon humano-alpha2b), y 3,0 x 10^6 / 9,0 x 10^6 (interferon humano- ). Como la eficiencia de reactivacion de cualquier proteina en el gel depende en gran medida de su naturaleza, las condiciones especificas de renaturalizacion (p. ej., el tampon, el tiempo de incubacion) se deben ajustar caso por caso.

Este nuevo conjunto de tecnicas conecta las separaciones rutinarias en geles de electroforesis con las caracterizaciones estructurales y biologicas de muestras valiosas, de un modo mas eficiente que los metodos convencionales de deteccion y de recuperacion.

References

1. LeGendre N, Matsudaira PT. Purification of proteins and peptide by SDS- PAGE. In: A practical guide to protein purification for microsequencing. Matsudaira, P. T. (ed.) Academic Press Inc 1993;49-69.

2. Hardy E et al. Electrophoresis 1996;17: 1537-1541.

3. Hardy E et al. Electrophoresis 1996;17: 26-29.

4. Hardy E et al. Anal Biochem 1997; 244: 28-32.

5. Tsai CM, Frasch CE. Anal Biochem 1982; 119:115-119.

6. Castellanos-Serra L et al. Electrophoresis 1996; 17:1564-1572.

7. Castellanos-Serra L et al. J Prot Chem 1997; en prensa.

8. Hardy E et al. Anal Biochem 1996; 240:150-152.

9. Fernandez-Patron C et al. Bio/Techniques 1992; 12:564-573.

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