Biotecnologia Aplicada Elfos Scientiae ISSN: 0684-4551 Vol. 14, Num. 4, 1997, pp. 233-236

Aislamiento, caracterizacion de las cepas de VIH-1 y titulo de anticuerpos contra p24 en seropositivos con progresion rapida y lenta a SIDA

*Enrique Noa, Leonor Lobaina, Marta Dubed, Olga L Vilarrubia, Hector M Diaz, Orfelina Rodriguez, Ana L Lubian, Maricela Izquierdo y Leonor Navea

Laboratorio de Investigaciones del SIDA. Apartado postal 23031. Marianao 14.Ciudad de La Habana. Cuba. Telf: (53-7) 78 3274; Fax: (53-7) 24 1682.

Recibido en septiembre de 1996. Aprobado en abril de 1997.

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ABSTRACT

The cytopathogenicity and replicative capacity of the HIV-1 isolates with the serological marker of anti p24 antibodies (Abp24) in serum, the co- infection with other human retroviruses, and the clinical evolution to AIDS were correlated in our study. The virus was isolated in all patients showing rapid progression to AIDS, most of the strains were of a high rapid growth and sincitium inducing, while virus recovery was lower in the long term survivors, and the cytopathogenecity of the isolated strains increased with the appearance of clinical symptoms. A high correlation between the Abp24 serological marker in the serum and the biological properties of the isolated strains was observed.

Key words: HIV, isolation, biological characterization, Abp24 titer, human retroviruses, clinic evolution

RESUMEN

En este estudio se relaciona la citopatogenicidad y capacidad replicativa de los aislamientos de VIH-1 con el marcador serologico de anticuerpos contra la p24 (Acp24) en suero, la coinfeccion con otros retrovirus humanos y la evolucion clinica al SIDA. El virus se aislo de todos los pacientes con progresion rapida al SIDA, y la mayoria de las cepas se caracterizaron por ser de crecimiento rapido alto e inductoras de sincicios, mientras el recobrado de virus fue menor en los sobrevivientes de largo periodo y la citopatogenicidad de las cepas aisladas se incremento con la aparicion de manifestaciones clinicas. Se observo correlacion entre el marcador serologico de Acp24 en suero y las caracteristicas biologicas de las cepas aisladas.

Palabras claves: VIH, aislamiento, caracterizacion biologica, titulo de Acp24, retrovirus humanos, evolucion clinica

Introduccion

La historia natural de la infeccion por el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) se caracteriza por su variabilidad en la duracion del periodo libre de sintomas, el cual esta determinado por factores del hospedero y/o viral. Dos determinantes de la interaccion virus-hospedero parecen jugar un mayor papel en la patogenesis del VIH: el fenotipo biologico del virus y el nivel de replicacion del mismo. Tambien influyen diferencias, determinadas geneticamente en el huesped, y la coinfeccion con otros virus (1-5).

El analisis de las caracteristicas biologicas (capacidad replicativa y citopatogenicidad) de cepas de VIH ha mostrado la variabilidad entre aislamientos obtenidos de diferentes individuos y en un mismo paciente en varios momentos de la infeccion, las cuales estan altamente relacionadas con la severidad de la infeccion en el seropositivo (1, 6, 7).

Los marcadores serologicos (disminucion de niveles de anticuerpos contra la proteina 24 (Acp24) y el aumento en la deteccion del antigeno p24 (Agp24), los niveles de Neopterina y beta2-microglobulina en el suero, la disminucion del numero de celulas T CD4^+, el desplazamiento del perfil de citoquinas de Th1 a Th2), y las caracteristicas biologicas de las cepas, permiten predecir la evolucion clinica de un seropositivo al VIH (2, 7- 10).

En este estudio se describe el aislamiento y la caracterizacion biologica de las cepas que infectan a un grupo de seropositivos a anticuerpos contra VIH-1, con rapida y lenta progresion al SIDA.

Materiales y Metodos

Pacientes

Se tomo sangre periferica con anticoagulante de 20 pacientes con anticuerpos (Ac) contra el VIH-1, que se encontraban en diferentes estadios clinicos de la infeccion.

Diez de estos pacientes evolucionaron a SIDA en menos de 3 anos, determinado por el tiempo transcurrido desde su posible fecha de contagio hasta que aparecieron los primeros sintomas que los clasificaban en grupo IV, por lo que se consideraron como progresores rapidos (PR) (11).

Diez seropositivos se consideraron como sobrevivientes de largo periodo (SLP), por tener mas de 8 anos de infectados, 5 de ellos en el momento de la toma de muestra presentaban manifestaciones clinicas menores de enfermedad que los clasificaban como grupo IV, progresores tipicos (PT), mientras los otros 5 permanecian asintomaticos, constituyendo el grupo de posibles no progresores (PNP) (11).

Estudios seroepidemiologicos

El suero de los pacientes, correspondiente al dia de la toma de muestra, se estudio para determinar Ac contra VIH-1, VIH-2 y HTLV-I/II, por los sistemas Vironostika HIV mixt (Organon, Holanda), ELAVIA II (Diagnostic Pasteur, Francia) y DAVIH HTLV-I (DAVIHLAB, Cuba), respectivamente, y se confirmaron por las tecnicas de immunobloting de DAVIH BLOT (DAVIHLAB, Cuba); NEW LAV BLOT II (Diagnostic Pasteur, Francia) y DAVIH BLOT HTLV-I (DAVIHLAB, Cuba). Ademas se realizo la titulacion de Ac contra la proteina p24 en suero, empleando el estuche DAVIH AcP24 (DAVIHLAB, Cuba).

Se recopilaron los datos de cada paciente de la fecha probable de infeccion, el tiempo que demoro en desarrollar las manifestaciones clinicas de la enfermedad, forma de contagio y numero de contactos.

Aislamiento viral

Las celulas mononucleares de sangre periferica (CMSP) de los pacientes, obtenidas por gradiente de Ficoll-Paque, se estimularon con fitohemaglutinina (DAVILAB FHA, Cuba) y se cocultivaron en relacion 1:1 con CMSP de donantes seronegativos sanos previamente estimulados con FHA, en medio RPMI-1640 suplementado con interleucina 2 (IL-2), polibrene y suero fetal bovino (SFB) al 10 %.

El cocultivo se mantuvo por 28 dias y se monitoreo una vez por semana la presencia de Agp24 en el sobrenadante libre de celulas utilizando un ELISA de captura de Agp24 (DAVIH Agp24, Cuba).

Se uso como criterio para considerar un aislamiento positivo que 2 pruebas de Agp24 fueran reactivas, con un incremento de la concentracion de Agp24.

Caracterizacion biologica

Los sobrenadantes de los cocultivos positivos se inocularon en CMSP de donantes sanos y en las lineas celulares linfociticas (CEM, JURKAT-TAT y MT4) y monocitica (U937).

Los cultivos se probaron una vez por semana en un periodo de 28 dias, adicionandoseles celulas frescas y medio RPMI-1640 suplementado con 10 % SFB y polibrene. El criterio seguido para considerar que un aislamiento se replicaba en las CMSP y/o en alguna de las lineas celulares, fue el mismo que se utilizo para determinar un aislamiento positivo.

Las cepas aisladas se clasificaron a partir de su tropismo celular preferencial (linfocitico y/o monocitico); la cinetica de replicacion: rapidas altas (RA) y lentas bajas tipo 1 (LB1), tipo 2 (LB2) o tipo 3 (LB3), y por su citopatogenicidad (capacidad de inducir sincicios (IS) o no inducir sincicios (NIS) en la linea celular MT4) (12).

Resultados

En todos los pacientes incluidos en este estudio, la forma de contagio fue por via sexual. En los de PR predomino la conducta homobisexual, en comparacion con los otros 2 grupos. Ademas es de destacar el numero pequeno de contactos sexuales reportados por los pacientes del grupo de los PNP (Tabla 1).

Tabla 1. Datos epidemiologicos y titulo de Acp24 en suero de los pacientes.

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Grupo de  Pacientes  Rango   Forma de contagio  Numero de   Titulo de
estudio             (meses) ------------------- contactos    Acp24          
                                 HB       HT     (rango)    (rango)
-----------------------------------------------------------------------  
PR          10       6-29        7        3       4-14      NR-puro
PT           5     100-112       1        4       1-17      puro-1:250
PNP          5      98-130       0        5       1-3       1:50-1:6250
-----------------------------------------------------------------------

El virus se logro aislar del 100 % de los pacientes con progresion rapida a SIDA (PR), y en los sobrevivientes de largo periodo (SLP) de un 50 % (5 de 10), de los cuales 3 aislamientos se logro de progresores tipicos (PT) (Tabla 2).

Tabla 2. Relacion entre el estadio clinico de la infeccion y la posibilidad de aislar el virus y el tropismo celular de sus cepas.

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Grupo de       Aislamiento                    Tropismo celular
estudio   -----------------------------------------------------------------
          Positivo    Negativo    CMSP    CEM    JURKAT-TAT    MT4    U937
---------------------------------------------------------------------------
PR           10          0         10      6         8          8      4
PT            3          2          3      2         2          2      0
PNP           2          3          2      0         0          0      0
---------------------------------------------------------------------------

Todos los aislamientos se replicaron en los cultivos de CMSP de donantes sanos; los que fueron capaces de replicarse en alguna linea celular presentaron un tropismo preferencial por las celulas de estirpe linfociticas (Tabla 2), solo 4 aislamientos de pacientes con PR se replicaron tambien en la linea celular monocitica U937.

La mayoria de los aislamientos de pacientes PR (8 de 10) se caracterizaron por tener alta produccion de Agp24 en los diferentes sustratos celulares empleados, desde los primeros monitoreos, por lo cual se clasificaron como LB3 o RA (Tabla 3, Figura 1).

Tabla 3. Cinetica de replicacion y capacidad de inducir sincicios de las cepas aisladas en relacion con el estadio clinico de la infeccion.

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Grupo de    Cinetica de replicacion    Capacidad
estudio   ---------------------------------------
            LB1    LB2    LB3    RA    IS    NIS
-------------------------------------------------
PR           2      0      2      6     8     2
PT           1      0      1      1     1     2
PNP          2      0      0      0     0     2
-------------------------------------------------

Figura 1. Niveles de Agp24 en sobrenadantes de cultivos primarios y lineas celulares continuas. Los datos son la media de los aislamientos capaces de replicarse en cada una de las celulas.

Al analizar la citopatogenicidad de las cepas aisladas en cuanto a su capacidad de inducir sincicios en la linea celular MT4 (Tabla 3), se observo que las 8 cepas de los pacientes con PR que se replicaron en esta linea celular indujeron sincicios; no asi las cepas aisladas de los PT, donde solo una de las 2 que se replicaron en ella fue inductora de sincicios.

En los pacientes con PR no se detecto titulo de Ac contra la proteina p24, solo el ELISA fue capaz de detectarla en la muestra pura de 3 de ellos. En los SLP el rango de titulo de Acp24 oscilo desde puro hasta 1:6250, estando el titulo en los PT siempre por debajo de 1:250 (Tabla 1).

En ninguno de los seropositivos se detecto Ac anti VIH-2 o anti HTLV- I/II.

Discusion

El recobrado de virus en cada grupo de estudio (100 % en los de PR y 50 % en los SLP) concuerda con lo publicado en la literatura, donde se ha observado una relacion directa entre la severidad de la infeccion en el hospedero y el porcentaje de recobrado viral, que puede ser hasta 100 % en pacientes con manifestaciones clinicas de SIDA (1, 6, 10, 12).

La probabilidad de aislar el virus se ha asociado al deterioro inmunologico que se observa en los pacientes en grupo IV o SIDA y la antigenemia p24 que acompana al empeoramiento clinico con una disminucion de los titulos de Acp24 en suero o plasma. Como se evidencio en nuestro estudio, en la medida en que estaba mas avanzada la evolucion clinica los titulos de Acp24 se hicieron mas bajos y el porcentaje de recobrado de virus aumento (2, 8, 9, 11, 13).

El tropismo preferencial linfocitotropico mostrado por nuestras cepas se corresponde con lo planteado por otros autores, quienes refieren que la mayoria de los aislamientos de pacientes con estadio clinico avanzado se multiplican preferencialmente en las lineas celulares linfociticas. Tambien se ha reportado que la capacidad de replicarse en lineas celulares continuas no es inherente a todos los aislamientos, por lo cual muchos son capaces de replicarse en cultivos primarios, pero no en lineas celulares continuas, incluso cepas aisladas de pacientes en estadio clinico de SIDA (3, 4, 6, 7, 12, 14).

En ninguna de las muestras de suero se detecto Ac contra VIH-2 o HTLV-I/II, por lo cual en este grupo de seropositivos se descarto el posible papel de estos retrovirus humanos en la evolucion clinica de los pacientes (4, 15, 16).

Las caracteristicas observadas en cuanto a la capacidad de replicarse de forma rapida y con altos titulos de Agp24 en los sustratos celulares empleados, asi como la capacidad de inducir sincicios en la linea celular MT4, ha reportado que estan altamente relacionadas con el estadio clinico de la infeccion y pueden predecir la posible evolucion clinica de un paciente. No obstante, la manifestacion de estas caracteristicas en cultivos in vitro puede estar influenciada por los sistemas de cultivo empleados en el aislamiento y expansion de los mismos (3, 5-7, 17).

La citopatogenicidad de las cepas que infectaban a los pacientes con progresion rapida a SIDA, asi como la via de contagio y numero de contactos de cada paciente, pudiera explicar la evolucion torpida de estos pacientes y el fallecimiento de todos ellos entre 3 y 4 anos posteriores a su posible fecha de contagio (3, 4, 7, 11, 12, 18, 19).

Las cepas aisladas de los PNP presentaron caracteristicas biologicas poco citopaticas y la carga viral resulto baja. Esta observacion coincide con la de otros investigadores en estudio de estos seropositivos, quienes han llegado a la conclusion de que, generalmente, los bajos titulos de virus con caracteristicas NIS, unido a altos titulos de anticuerpos anti p24 y a propiedades geneticas e inmunologicas de cada persona, permite que estos permanezcan por un largo periodo sin presentar sintomas de la infeccion (2, 5, 7, 9-11, 13, 20).

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