Biotecnologia Aplicada Elfos Scientiae ISSN: 0684-4551 Vol. 14, Num. 4, 1997, pp. 267-269

Nuevo programa de calculo. Cuantificacion de la actividad antiviral de interferones mediante la inhibicion de efecto citopatogenico utilizando el sistema de equipos suma

Joel Ferrero Bibilonia,^1 Ladys Duany Zamora,^1 Juan Y Remon Milan,^1 Maribel Vega^1 y Pedro Lopez Saura^2

^1 Subdireccion de Calidad,
^2 Division de Ensayos Clinicos. Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia, apartado postal 6162, Ciudad de La Habana, Cuba.

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lntroduccion

La determinacion de la actividad antiviral de interferon (IFN) es una tecnica necesaria en los laboratorios que trabajan con estas moleculas para propositos como el control y desarrollo de procesos de produccion, de la calidad de los productos finales, determinacion de niveles de IFN endogeno, asi como capacidad de produccion de estas sustancias en individuos sanos y enfermos, control de tratamientos con IFN, determinacion de la presencia de anticuerpos neutralizantes de la actividad antiviral, y otras investigaciones relacionadas con la produccion y el mecanismo de accion de los IFN. Todos los problemas anteriormente relacionados requieren un metodo de determinacion confiable, seguro y rapido. Generalmente se utilizan metodos que se basan en la inhibicion del efecto citopatico (ECP) producida por el IFN en celulas retadas con algun virus. En nuestro pais se usa este sistema (1), tinendo al final las celulas con un colorante y leyendo la intensidad de la coloracion en el equipo SUMA (Centro de Inmunoensayo, La Habana). El procedimiento presentaba aun varias limitaciones como son el que la computadora acoplada al equipo de lectura no es IBM compatible, lo que dificulta la interrelacion con el resto de los sistemas de control automatico en uso y el programa de calculo de los resultados no contemplaba todos los parametros exigidos par las regulaciones internacionales.

En este trabajo se presentan los resultados de utilizar el fotometro del sistema SUMA para leer la coloracion de los pozuelos secos de las placas de titulacion de la actividad antiviral y el calculo del titulo de IFN mediante un programa desarrollado en el software EXCEL 5 para Windows, que tiene en cuenta todos los puntos de diluciones de las microplaca. Este programa se aplico al estudio colaborativo para el establecimiento de un patron internacional de interferon alfa.

Materiales y Metodos

Se utilizaron celulas HEp-2 (ATCC No. CCL 23) multiplicadas en medio MEM suplementado con 10 % de suero de ternera fetal, 2,2 mg/mL de bicarbonato de sodio y 40 ug/mL de gentamicina, e incubadas a 37 C y 3 % de CO2. Las Celulas se emplearon despues de 3 a 10 pases. Como virus productor de ECP se utilizo el Mengo (cepa del Instituto de Biologia Molecular, Universidad de Zurich, 1982), multiplicado en fibroblastos de raton L929.

Se usaron muestras de IFN alfa leucocitario de distintos origenes: 2 preparaciones de patrones internos (L3 y L4), 2 de patrones internacionales de la OMS (69-19 y Ga23-902-530) y una muestra de un lote de produccion de IFN alfa leucocitario.

Para el estudio colaborativo se emplearon 10 muestras denominadas A, B, C, D, E, F, G, H, J y K distribuidas por la National Institute for Biologicals and Control de Gran Bretana, por encargo de la OMS. Estas muestras se recibieron liofilizadas en ampulas y fueron reconstituidas con 1 mL de agua de inyeccion. Posteriormente fueron diluidas segun los titulos supuestos que traian asignados.

Se empleo la tecnica de titulacion establecida en los procedimientos Patrones de Operacion para esta actividad. Las placas de titulacion, una vez tenidas, fueron leidas secas en el equipo SUMA. El programa de calculo toma estos resultados y i): calcula el valor promedio de los controles de virus y celulas de la placa, eliminando un punto que se aleje mas de 1,3 desviaciones standard (DS) de la media; ii): normaliza todos los valores de absorbancia de la placa, ajustandolos a 0 (control del virus) y 100 (control de celulas). Los valores extremos (mayores que 0,99 y menores que 0,01) no seran tenidos en cuenta posteriormente; iii): realiza la transformacion Probit de los valores anteriores para lograr la linealidad de los 8 puntos correspondientes a las diluciones de cada muestra; iv): hace el analisis de regresion de los valores anteriores vs. las diluciones para cada muestra; v): elimina los puntos que se alejen de la recta de regresion en mas del valor del intervalo de confianza al 75 % de la misma; vi): recalcula la recta de regresion; vii): calcula la dilucion que corresponde al valor Probit = 5 (50 % de proteccion de las celulas por el IFN); viii): calcula el titulo como el antilog2 de la dilucion anterior, multiplicado por las diluciones previas que haya sufrido la muestra y ix): compara las pendientes de las rectas de regresion entre si, para el analisis de paralelismo de la relacion dosis-respuesta de las muestras.

Resultados y Discusion

El grafico de las lecturas de absorbancia en funcion de la dilucion es una curva sigmoidal. Otros grupos en el mundo calculan la dilucion que corresponde a 50 % de proteccion (punto medio entre las lecturas de los controles de virus y celulas) tomando los puntos de esta curva que permitan trazar una recta y asegurandose que el valor de 50 % este incluido en ella. Esto implica la seleccion visual de los puntos que van a ser tomados. La transformacion Probit, al linealizar el grafico, permite utilizar todos los puntos. Solamente se eliminan del calculo aquellos que constituyen valores extremos o que sean errores groseros. Sin embargo, en el programa que se presenta esta seleccion se realiza automaticamente evitando la decision subjetiva del operador. Figura 1 y 2.

Figura 1. Comparacion entre los procedimientos de calculo a partir de las lecturas de absorbancia o de sus transformaciones Probit. Las flechas indican el punto de 50 % de proteccion y el Log2 de la dilucion correspondiente.

Figura 2. Ejemplos de resultados obtenidos; A: resultados de 2 muestras cuyas pendientes no fueron diferentes estadisticamente; B: 2 muestras con pendientes que fueron diferentes estadisticamente.

El calculo de las pendientes, que se realiza automaticamente tampoco arrojo diferencias significativas entre las muestras ensayadas por lo que se puede concluir que hubo paralelismo entre las mismas, lo cual era de esperar al tratarse del mismo tipo de interferon.

En cuanto al estudio colaborativo se titularon las muestras en 4 ocasiones, se calcularon los titulos y se hicieron los analisis de paralelismo de las pendientes. Los resultados fueron enviados al NIBSC y formaran parte del analisis conjunto internacional.

El programa de calculo constituye una mejora con relacion al existente actualmente en los aspectos como; I): elimina los puntos que constituyen errores groseros con relacion a la recta de regresion lo que mejora la precision del calculo; ii): hace analisis de paralelismo de las muestras de una misma placa mediante la comparacion de las pendientes de las rectas de regresion, como establecen las recomendaciones internacionales para el control de las preparaciones de interferon; iii): esta desarrollado en EXCEL para Windows, lo que permitira acoplarlo facilmente a los nuevos modelos de equipos SUMA y IBM compatibles; iv): permite acumular los valores para analisis historicos y otros calculos que se desee hacer con ellos; v): puede aplicarse a otros ensayos de actividad que se basen en medicion del crecimiento o numero de celulas, EGF e IL-2.

References

1. Ferrero J, Ochagavia ME, Aguilera A, Lopez-Saura P. Titulacion de la actividad antiviral de interferon utilizando el sistema de equipos SUMA. Biotecnologia Aplicada 1994;11(1):34-42.

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