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EFECTO DE LA PASTEURIZACION SOBRE ALGUNAS PROPIEDADES DEL FACTOR DE TRANSFERENCIA Fernando Fernandez,^1 Marisela Suarez,^2 Wilfredo Diaz,^2 Haydee Geronimo,^2 Fernando Porrero^2 y Celia Fernandez-Ortega^2
^1 Banco de Sangre Provincial "Renato Guitart". Apartado postal 1040,
Santiago de Cuba, Cuba.
Recibido en febrero de 1996. Aprobado en junio de 1997.
Code Number: BA98003
ABSTRACT The influence of pasteurization on some physical-chemical and biological properties of the human transfer factor was studied. Results did not show significant changes in protein concentration, pH, UV spectrum and absorbance (260/280 nm) after the virucidal procedure. Leukocyte inhibitory factor stimulation was maintained after the pasteurization in all tested batches. Key words: pasteurization, virucidal procedure, transfer factor, validation RESUMEN Se estudio la influencia de la pasteurizacion sobre algunas propiedades quimico-fisicas y biologicas del factor de transferencia humano. Los resultados no mostraron diferencias significativas en la concentracion proteica, pH, espectro de absorcion UV y absorbancia (260/280 nm) despues del procedimiento virucida. La estimulacion del factor inhibitorio de la migracion leucocitaria se mantuvo presente despues del proceso de pasteurizacion en todos los lotes estudiados. Palabras claves: pasteurizacion, procedimiento viral, factor de transferencia, validacion Introduccion En Cuba se ha aplicado con exito el extracto dializable de leucocitos humanos (EDL) con actividad de factor de transferencia (FT) en el tratamiento de herpes simple (1) y herpes zoster (2), de asma (3, 4), de cancer de ovario (5) y de leucemias agudas (6). Se ha reportado tambien eficacia de este medicamento en el incremento de la supervivencia de pacientes infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) (7, 8); ademas, para este producto se ha encontrado actividad anti-VIH in vitro (9). Este farmaco se obtiene a partir de leucocitos que produjeron interferon (IFN) (10), de manera que, si bien los progresos en la seleccion de donantes y la introduccion de metodos cada vez mas sensibles de deteccion de agentes virales ofrecen un determinado margen de seguridad a los hemoderivados, se conoce que pudieran presentarse particulas infectivas en concentraciones inferiores a las detectables por las tecnicas habitualmente utilizadas, ademas de que cualquier nueva entidad infecciosa pasara "silenciosa" ante estos analisis (11). En la produccion de FT, la posibilidad de contaminacion viral esta presente debido al empleo de mezclas de hasta 6 000 concentrados de leucocitos.
En la actualidad se han desarrollado y descrito varios metodos de inactivacion/eliminacion de virus en la produccion de biologicos, y uno de los mas efectivos es el calentamiento en solucion a 60 C durante 10 h (pasteurizacion). Con este proceso se han reportado disminuciones de mas de 5,6 log de dosis infectiva media (ID50) para virus de hepatitis B, mas de 5,5 log ID50 para virus de hepatitis C y mas de 6 log ID50 para VIH en las producciones de albumina e inmunoglobulinas (12). Tambien se reporta con esta tecnica la reduccion de mas de 4 log ID50 de VIH en la elaboracion de Factor VIII concentrado (13), asi como 7 log ID50 de VIH-1 y 5,5 log ID50 de Sindbis virus para el proceso de obtencion de Antitrombina III (14). Sin embargo, esta metodologia tiene el inconveniente de que solo puede aplicarse si se demuestra que no provoca afectaciones en el producto que alteren sus propiedades quimico-fisicas y biologicas. En el presente trabajo se estudia el efecto de la pasteurizacion en el FT, con vistas a su posible utilizacion como paso de inactivacion viral en la produccion de este medicamento. Materiales y Metodos Preparacion del FT Para la realizacion de los estudios propuestos se emplearon 5 lotes de FT preparados de leucocitos purificados de aproximadamente 6 000 donaciones de diferentes individuos. Los globulos blancos habian sido previamente inducidos a producir IFN alfa natural (15). El factor de transferencia se obtuvo lisando las celulas mediante ciclos de congelaciones- descongelaciones sucesivas y ultrasonido. Despues de dicho tratamiento se obtuvo una pasta que fue dializada durante 24 h contra tampon fosfato salino (PBS), pH 7,4, a traves de membranas (Gallenkap) de 10 000 Da de exclusion molecular (10). Se considero como una unidad (1 U) de FT el producto resultante de la dialisis de 5 x 10^8 leucocitos. Pasteurizacion Se tomaron 50 mL de cada dializado y se calentaron durante 10 h a 60 C, definiendose el tiempo cero a partir de que el producto alcanzo la temperatura de pasteurizacion. Luego, el material se dejo en reposo a temperatura ambiente durante 2 h y posteriormente se almaceno a -70 C hasta la realizacion de los analisis previstos. Caracterizacion quimico-fisica de la preparacion Se estudiaron 5 lotes de EDL. En todos los casos se determino el pH, el espectro de absorcion ultravioleta, en el rango comprendido entre 200 y 300 nm, el indice de correlacion de los valores de densidad optica de 260 nm respecto a 280 nm (DO260/280) y la concentracion de peptidos presentes segun el metodo de Lowry. Estos ensayos se realizaron antes y despues del calentamiento en solucion del FT. Se determino si existian diferencias significativas antes y despues del procedimiento segun la prueba "t" para series apareadas (16) para un nivel de confianza del 95 %. Determinacion de la actividad biologica La determinacion de actividad biologica del FT, antes y despues de pasteurizado, se llevo a cabo estudiando la presencia de factor inhibitorio de la migracion leucocitaria (LIF). El ensayo de inhibicion de la migracion leucocitaria en agarosa (17) se realizo tomando 25 mL de sangre humana total fresca heparinizada, a la cual se anadio igual cantidad de dextrana 70 000 (Pharmacia) al 6 %, y se dejo reposar durante 45 min. El sobrenadante se separo cuidadosamente y se lavo con igual cantidad de PBS y luego con RPMI-1640 (Gibco) suplementado con 10 % de suero fetal de ternera (Integra Biosciences) mediante centrifugaciones sucesivas a 400 x g durante 10 min.
La concentracion leucocitaria se ajusto a 2 x 10^7 celulas/mL con la misma solucion de medio empleada en los lavados; 1 mL de la suspension celular se centrifugo a 400 x g durante 10 min y el precipitado resultante se resuspendio en una mezcla a partes iguales de medio RPMI-1640 2x (se prepara disolviendo 10,44 g en 500 mL de agua bidestilada) y agarosa (Sigma) al 6 %; 2 L de la mezcla asi obtenida se depositaron en cada pozo de una placa de fondo plano de 96 pocillos (Nunc), y se anadio en los pocillos correspondientes los controles de antigeno (Candidina 1:10) y las muestras a una dilucion final de 1:4.
La placa se incubo de 18 a 24 h a 37 C en atmosfera de 5 % de CO2 y humedad relativa del 95 %. Despues se procedio a la medicion de la migracion leucocitaria con la ayuda de un lector de microfilmes.
El indice de inhibicion de la migracion leucocitaria (IIML) se calculo dividiendo el valor de la migracion de las celulas en presencia de la muestra mas el antigeno entre el valor en presencia del antigeno. Los valores de migracion asi obtenidos resultaron de la media de 4 replicas para cada muestra. La inhibicion se considero positiva si el IIML asi calculado resulto inferior o igual a 0,8 al menos en 2 de 6 determinaciones con leucocitos de individuos diferentes (18). Resultados y Discusion En la Tabla 1 se muestran algunos parametros quimico-fisicos (pH, peptidos y relacion DO260/280 nm) de los lotes no tratados y tratados. En ningun caso se encontro diferencias significativas antes y despues del tratamiento, lo que concuerda con resultados ya reportados (19) y confirma el criterio de la estabilidad quimica del dializado con posterioridad al tratamiento termico. Tabla 1. Comportamiento de algunos parametros quimico-fisicos de los lotes de FT antes y despues de pasteurizados.
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Indicadores analizados
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Lote pH Peptidos (mg/mL)
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Antes Despues Antes Despues
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1 6,89+/-0,01 6,91+/-0,03 0,81+/-0,01 0,78+/-0,02
2 7,00+/-0,12 7,01+/-0,08 0,80+/-0,02 0,72+/-0,02
3 7,01+/-0,05 7,02+/-0,02 0,78+/-0,01 0,76+/-0,01
4 7,03+/-0,09 7,03+/-0,11 0,76+/-0,09 0,66+/-0,09
5 7,04+/-0,06 7,02+/-0,02 0,69+/-0,17 0,66+/-0,08
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Tabla 1 (continued)
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Indicadores analizados
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Lote DO260/280
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Antes Despues
1 1,81+/-0,04 1,75+/-0,03
2 1,74+/-0,02 1,71+/-0,06
3 1,88+/-0,09 1,86+/-0,04
4 1,74+/-0,07 1,73+/-0,08
5 1,75+/-0,03 1,75+/-0,10
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Cada resultado es el valor medio+/-la desviacion estandar de 3 experimentos
por separado. En la Figura 1 se muestra el espectro de absorcion UV del FT antes y despues de la pasteurizacion, de manera que cada punto esta constituido por el promedio de las lecturas correspondientes a los 5 lotes estudiados. El analisis corrobora que el tratamiento por calor no influye sobre el espectro caracteristico del producto en el rango estudiado (200-300 nm), ya que no muestra patrones de descomposicion como ocurre en otros trabajos publicados (20) al calentar el FT a 100 C.
Como se observa en la Tabla 2, la positividad del LIF (expresada como el IIML inferior o igual a 0,8 al menos en 2 de 6 pruebas con leucocitos de individuos diferentes) estuvo presente en 3 de los 6 experimentos realizados a los lotes estudiados. Asi, los resultados indican que la pasteurizacion no afecta la estimulacion de esta linfoquina, que conjuntamente con otras participa en los mecanismos de inmunidad celular. Tabla 2. Estimulacion de la produccion de LIF^a por el FT no pasteurizado (NP) y pasteurizado (P), respectivamente.
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ndice de inhibicion de la migracion leucocitaria^b
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Experimentos 1 2 3 4 5 6
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Lote NP P NP P NP P NP P NP P NP P
1 0,63 0,76 1,02 1,08 0,56 0,60 0,84 0,87 0,52 0,54 1,00 1,13
2 0,73 0,80 0,90 0,87 0,63 0,75 0,88 0,86 0,78 0,69 1,11 0,98
3 0,56 0,53 0,97 0,93 0,55 0,71 1,03 1,01 0,61 0,46 1,03 1,08
4 0,52 0,61 0,83 0,89 0,52 0,78 0,86 0,97 0,60 0,66 1,16 1,13
5 0,71 0,75 1,08 1,10 0,57 0,72 0,98 1,12 0,66 0,61 0,98 1,03
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^a Se utilizo candidina (1:10) como antigeno sensibilizante. ^b Media del indice de inhibicion de la migracion leucocitaria en experimentos por triplicado. La desviacion estandar en ningun caso supero el 10 % de la media. Un aspecto de interes es que en los experimentos realizados no se utilizo ninguna sustancia estabilizante de proteinas durante el calentamiento, lo cual se conoce que contribuye tambien a incrementar la estabilidad de los virus y constituye uno de los aspectos negativos que se le senalan a la pasteurizacion (12). Por otra parte, es preciso destacar que aunque los experimentos se realizaron a pequena escala (aproximadamente 0,7 %), los indicadores quimico-fisicos y biologicos estan dentro de los rangos de aceptacion del producto obtenido a escala productiva, de manera que en las condiciones en que se realizo el trabajo es posible afirmar que el calentamiento en solucion durante 10 h a 60 C, no afecta las propiedades quimico-fisicas y biologicas del FT, por lo cual este producto es resistente a la metodologia descrita y los resultados pueden ser reproducibles a escala de produccion. References 1. Gonzalez E, Diaz de La Rocha A, Sagaro B, Fernandez-Ortega C. Valor terapeutico del factor de transferencia en el herpes simple. Estudio a doble ciegas. Biotecnologia Aplicada 1993;10(1):3-4. 2. Cabezas-Quiroga R, Estrada Parra S, Padierna L, Padierna J, Fernandez C, Lopez P. Inmunoterapia con factor de transferencia en pacientes con herpes zoster. Biotecnologia Aplicada 1990; 7(1):52-57. 3. 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