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OBTENCION DE ADN UTIL PARA AN LISIS DE TIPAJE GENETICO A PARTIR DE RESTOS OSEOS HUMANOS ANTIGUOS Eileen Riego,^1 Ricardo Lleonart,^1 Ma. Victoria Sainz de la Pena,^2 Fermin Amaro,^3 Ketty Bacallao,^3 Marta Santiesteban,^2 Felipe Rolo,^4 Luis Herrera,^1 Madelyn Blanco^4 y Jose de la Fuente^1
^1 Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia. Apartado postal 6162, La
Habana, Cuba. E-mail: orsup@cigb.edu.cu; Fax: (53 7) 21 8070 33 8008.
Recibido en mayo de 1997. Aprobado en octubre de 1997.
Code Number: BA98004
ABSTRACT Although several methods have been described to extract human DNA from bone tissues, the results are variable and sometimes the purified DNA is not suitable for polymerase chain reaction analysis. Specially for forensic applications where PCR mediated typing of short tandem repeats STR loci is imperative, the presence of inhibitors of the T. aquaticus DNA polymerase is often an insoluble difficulty. Here we describe methods which has been used in our laboratory for some time already to do the genetic typing of several short tandem repeats loci on genomic DNA extracted from ancient bone remains as well as the amplification and sequencing of the hypervariable region of the human mitochondrial DNA from the same specimens. The usefulness of the method was documented even with bone remains 2 000 years old. These results are important not only from the forensic point of view but also for the applications of the so called "molecular archaeology techniques" to help trace back the origins of ancient human populations. Key words: genetic typing, bone, polymerase chain reaction, PCR, short tandem repeats, STR, mitochondrial DNA RESUMEN En ocasiones resulta de vital importancia para la aplicacion de tecnicas forenses el tipaje del ADN a partir de muestras oseas. Con frecuencia, sin embargo, la aplicacion de estas tecnicas se ve fuertemente afectada por factores tales como la inhibicion de actividad enzimatica de la ADN polimerasa de T. aquaticus que queda en estas preparaciones de ADN, los bajos rendimientos, el alto grado de degradacion de los acidos nucleicos extraidos, etc. Varios autores reportan procedimientos para la purificacion de ADN a partir de muestras oseas, sin embargo, los resultados son muy variables en terminos de rendimiento y utilidad del material extraido como sustrato de reacciones tales como la reaccion en cadena de la polimerasa. Aqui se describe un procedimiento que rinde ADN util para el tipaje genetico de fragmentos repetidos cortos en tandem y ADN mitocondrial humano a partir de restos oseos antiguos. Este metodo se ha usado de forma rutinaria en nuestro laboratorio para estudios forenses y de poblaciones aborigenes antiguas. Palabras claves: tipaje genetico, hueso, reaccion en cadena de la polimerasa, PCR, fragmentos repetidos cortos en tandem, STR, ADN mitocondrial Introduccion La introduccion de conocimientos generados por los constantes avances de la biologia molecular a ramas mas tecnologicas, tales como las ciencias forenses, ha permitido grandes avances en la identificacion de individuos, sus restos, etc. Tecnicas tales como el llamado "DNA fingerprinting", que en espanol pudiera traducirse como "huellas digitales geneticas", son una muestra de ello. Mas recientemente, la implementacion del analisis de los fragmentos cortos repetidos (short tandem repeated polymorphisms, STR) a partir de ADN genomico, ha permitido un salto cualitativo en estas tecnicas (1-3). Con la aplicacion de la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) se ha logrado trabajar con cantidades infimas de muestra y obtener los resultados mas rapidamente. Otra tecnica que recientemente se ha comenzado a usar y ha mostrado gran versatilidad para el tipaje genetico, es el analisis de los polimorfismos (tambien mediante el uso del PCR) de la region de control del ADN mitocondrial humano (4-6).
Si bien la aplicacion de estas nuevas metodologias es relativamente sencilla para examinar muestras biologicas frescas, su uso en especimenes antiguos (por ejemplo, huesos provenientes de enterramientos) se hace mas dificil debido, entre otras causas, a la poca cantidad de ADN amplificable que queda en estos, su estado de degradacion y a la presencia de compuestos que inhiben fuertemente la actividad enzimatica de la ADN polimerasa de T. aquaticus.
En este trabajo se reporta una metodologia que permite de forma reproducible la extraccion de ADN a partir de restos oseos antiguos. El ADN extraido por estos procedimientos ha sido usado de forma rutinaria en nuestro laboratorio para el tipaje de STR y ADN mitocondrial para trabajos de identificacion forense y estudios poblacionales de comunidades indigenas precolombinas de nuestro pais. Materiales y Metodos Muestras Se utilizaron muestras oseas provenientes de enterramientos en zona de selva tropical con edades entre 35 y 2 000 anos, esta ultima fechada mediante C^14 (7); el estado de conservacion vario en dependencia del tipo de muestra. Aquellas provenientes de enterramientos por 35 anos en tierra selvatica mostraban buena consistencia pero variaban en cuanto a color. Los restos provenientes de enterramientos aborigenes con mas de 2 000 anos, por estar dentro de una cueva, presentaron en algunos casos un alto grado de calcificacion y la muestra se disgregaba facilmente al ser manipulada (muestra A en la Figura 1).
Se organizo un flujo de trabajo destinado a reducir al maximo el riesgo de contaminaciones, siguiendo las principales medidas reportadas como efectivas por la literatura (8). En resumen, se separaron fisicamente las areas de trabajo pre y post-PCR, se destino equipamiento exclusivo para cada area, se regulo el acceso de personal a estas, se hizo uso de equipos de flujo laminar para el montaje de las reacciones y la purificacion del ADN, y se uso en todo momento vestuario esteril, guantes y pipetas a prueba de aerosoles. En cada extraccion se incluyeron controles negativos en paralelo que contenian todos los componentes a excepcion de la muestra osea, y el PCR fue ademas controlado mediante reacciones sin ADN. Extraccion de ADN Fragmentos pequenos de muestra (preferiblemente de huesos largos) fueron pulverizados en N2 liquido. El polvo (5 g) fue descalcificado en presencia de 50 mL de 0,5 M EDTA pH 7,5; tres veces durante 12 h con agitacion. Para cada cambio de solucion se centrifugo la muestra durante 10 min a 1 800 x g. La muestra se lavo tres veces con agua destilada esteril. El precipitado final se resuspendio en solucion tampon de extraccion (Tris-HCl pH 8, 10 mM, EDTA 10 mM, NaCl 100 mM, SDS 2 %, proteinasa K 0,5 mg/mL) y se incubo con agitacion ocasional durante 12 h a 56 C. Seguidamente se anadio Proteinasa K adicional para alcanzar la concentracion de 1 mg/mL y se incubo de igual forma durante otras 5 h. El material no digerido fue eliminado por centrifugacion y el sobrenadante se extrajo con fenol / cloroformo / alcohol isoamilico (25:24:1) tres veces. Las trazas de fenol que quedaron tras las extracciones fueron eliminadas mediante una extraccion con eter dietilico. El eter remanente se elimino mediante calentamiento de la fase acuosa a 56 C durante 15 min. El sobrenadante asi obtenido fue concentrado y dializado usando Centricon 100 (Amicon, USA). El concentrado se lavo con tres volumenes de agua destilada esteril. El ADN fue conservado a -20 C. Cuantificacion de acidos nucleicos La cantidad de ADN total humano presente en las muestras fue estimada mediante el kit de cuantificacion de ADN "QuantiBlot" (Perkin Elmer Part No. N808-0114, USA). Tipaje de acidos nucleicos Analisis de STR. Alicuotas de ADN fueron usadas en reacciones de amplificacion en cadena de la polimerasa (PCR) que contenian juegos de oligonucleotidos disenados para amplificar los alelos HUMCSF1PO, HUMTHO1, HUMTPOX, HUMF13A, HUMFES/FPS, HUMF13B, HUMHPRTB, HUMvWA, HUMLPL y amelogenina (1-3). En todos los casos las reacciones (25 uL, volumen total) se llevaron a cabo en presencia de KCl 50 mM, Tris-HCl pH 9,0 a 25 C 10 mM, MgCl2 1,5 mM, Triton^R X-100 0,1 %, 0,2 mM cada dNTP, 12,5 pmol de cada oligonucleotido, y 0,5 - 10 unidades de Taq Polimerasa (Heber Biotec SA, CIGB, La Habana, Cuba). En cada caso particular se probaron diferentes cantidades de ADN en la reaccion (0,1 - 2,5 ng) y se incluyo albumina de suero bovino acetilada (170 ug/mL, Biolabs, USA). Se utilizo para el ciclado termico un Minicycler^TM (MJResearch, USA), empleando dos programas: Programa 3 (para los marcadores F13B, FESFPS, HPRTB, LPL, y vWA), 96 C por 2 min, 10 ciclos de (94 C por 1 min, 60 C por 1 min, 70 C por 1,5 min), y 20 ciclos de (90 C por 1 min, 60 C por 1 min, 70 C por 1,5 min); Programa 5 (para los marcadores Amelogenina, CSF1PO, F13A01, TH01 y TPOX), 96 C por 2 min, 10 ciclos de (94 C por 1 min, 64 C por 1 min, 70 C por 1,5 min), y 20 ciclos de (90 C por 1 min, 64 C por 1 min, 70 C por 1,5 min).
Parte del producto de PCR (2,5 uL) fue anadido a 2,5 de solucion tampon de aplicacion (NaOH 10 mM, formamida 95 %, bromofenol azul 0,05 %, Xylene cyanol 0,05 %), desnaturalizado a 95 C por 2 min, y aplicado en un gel desnaturalizante de poliacrilamida (acrilamida 6 %, urea 7 M, TBE 1X) de 27,5 cm x 21,5 cm x 0,4 mm. La corrida fue a corriente constante (25 W), para una temperatura del gel de aproximadamente 55 C. Luego de la corrida, el gel fue tenido usando un kit de tincion con plata segun las instrucciones del fabricante (Promega, USA). La asignacion de alelos se realizo por comparacion visual con marcadores alelicos de talla suministrados por el mismo fabricante. Analisis de ADN mitocondrial Se realizaron reacciones de PCR usando las mismas condiciones descritas en el acapite anterior excepto que se emplearon cuatro pares de oligonucleotidos descritos (9) para amplificar las regiones hipervariables HVI y HVII del ADNmh. Se uso el programa MITO para la amplificacion: 96 C por 2 min y 36 ciclos de (94 C por 1 min, 60 C por 1 min, 72 C por 1 min). El producto de PCR fue verificado en gel de agarosa (1,2 %, TBE 1X). El producto en la talla correcta se extrajo del gel mediante adsorcion a silica (GENO-BIND Clontech, USA) y 1 ng de banda se uso como sustrato para un segundo PCR. Una vez concluido este, fue extraido con cloroformo y la fase acuosa sometida a precipitacion durante 15 min a 0 C luego de anadirle 1/10 vol de NaAcO 3 M y 0,6 vol isopropanol. La mezcla fue centrifugada 10 min a temperatura ambiente (12 000 rpm), y el pellet fue secado y disuelto en 15 uL de agua destilada esteril. Siete microlitros de este ADN se usaron para secuenciacion directa de doble cadena segun procedimientos descritos (Sequenase Version 2.0 DNA sequencing kit, USB, USA). Resultados y Discusion Para este trabajo se emplearon huesos con diferente tiempo de enterramiento en condiciones ambientales tipicas del tropico, oscilando entre 35 y aproximadamente 2 000 anos (Figura 1). Estas ultimas muestras fueron fechadas mediante metodos radioisotopicos (7). Varios metodos han sido descritos por la literatura para la extraccion de ADN de restos oseos (10-14), aunque con frecuencia se reportan resultados variables con algunas muestras en lo que respecta a rendimiento y calidad del ADN extraido. Es notoria tambien la influencia del tipo de terreno y las condiciones ambientales de la zona sobre el estado de conservacion de los restos y a su vez sobre el rendimiento y calidad del ADN obtenido, entendida esta ultima como una medida de la factibilidad de usar ese ADN como sustrato de reacciones enzimaticas tales como digestiones con enzimas de restriccion, amplificacion enzimatica, etc. Aunque este fenomeno lo pudimos corroborar como tendencia, es importante notar que tanto el rendimiento como la "amplificabilidad" del ADN extraido fueron parametros muy variables, incluso para restos provenientes de un mismo enterramiento. Esta falta aparente de regularidad entre las caracteristicas del material oseo y la cantidad y calidad del ADN extraido se debe muy probablemente a la existencia de contaminantes y otras variables desconocidas hasta el momento y no controladas en los experimentos.
En este estudio se presenta un procedimiento que cuando se aplico a diferentes muestras oseas permitio la obtencion de ADN humano (Figura 2) apropiado para la amplificacion enzimatica de diferentes loci tanto genomicos como de ADN mitocondrial. En nuestras condiciones, este metodo permitio rendimientos superiores que cuando las mismas muestras fueron extraidas con algunos de los procedimientos reportados (13, datos no mostrados). Las cantidades de ADN humano total obtenidas oscilaron entre 0,1 y 0,8 ng por gramo de hueso. Estos resultados estan dentro del rango de los rendimientos reportados por otros autores (13).
En todos los casos el ADN extraido fue susceptible de ser usado para genotipar varios loci genomicos (STR, Figura 3) y caracterizar los polimorfismos presentes en la region de control del ADN mitocondrial humano de los restos (Figura 4). En varias de las muestras, no obstante, se hizo necesario el uso de albumina de suero bovino para inactivar una actividad inhibidora de la Taq polimerasa que no fue posible obviar por simple dilucion del ADN (Figura 3). Esta esporadica aparicion de inhibidores de la enzima en muestras provenientes de enterramientos ha sido descrita por varios autores (3, 13, 15). En todos los casos se siguio rigurosamente el diseno organizativo descrito para evitar o minimizar posibles eventos de falsos positivos. Estas precauciones se hicieron aun mas necesarias por el hecho de que en nuestras condiciones las reacciones de PCR fueron extremadamente sensibles, llegandose a amplificar cantidades de templado del orden de los picogramos. La presencia en todos los experimentos de los apropiados controles, asi como los resultados consistentes obtenidos cuando se hicieron varias replicas de cada muestra, permitieron descartar esta posibilidad.
Figura 4. Autorradiograma de gel de secuencia del ADN mitocondrial, amplificado a partir de dos muestras diferentes de ADN total humano antiguo; A, de hueso de 35 anos de antiguedad; B, a partir de sangre de un supuesto familiar (control positivo). Las flechas senalan algunas de las diferencias encontradas en la region hipervariable I.
Esta metodologia ha sido ya utilizada de forma rutinaria en nuestro laboratorio para la identificacion de muestras con interes forense, analisis de paternidad, y en el caso de muestras mas antiguas, para estudios poblacionales con restos de aborigenes precolombinos en nuestro pais (manuscritos en preparacion). References 1. Robertson JM, Sgueglia JB, Badger CA, Juston AC, Ballantyne J. Forensic applications of a rapid, sensitive, and precise multiplex analysis of the four short tandem repeat loci HUMVWF13/A, HUMTH01, HUMF13A01, and HUMFES/FPS. Electrophoresis 1995;16: 1568-1576. 2. Gill P, Kimpton CP, Urquhart A, Oldroyd N, Millican ES, Watson SK, Downes TJ. Automated short tandem repeat (STR) analysis in forensic casework - a strategy for the future. Electrophoresis 1995;16:1543-1552. 3. de Pancorbo MM, Castro A, Alonso S, Fernandez-Fernandez I, Barbero C, Garcia-Orad A et al. Genetic typing with HUMTH01, HUMVWA31A and HUMFES/FPS short tandem repeat loci, D1S80 variable number tandem repeat and HLA-DQ of recent and from XII-XIII centuries spongy bone. Electrophoresis 1995; 6:1612-1616. 4. Budowle B, Adams DE, Comey CT, Merril CR. Mitochondrial DNA: A possible genetic material suitable for forensic analysis. In: Lee HC, Gaensslen RE, editors. Advances in Forensic Sciences. Year Book Medical Publishers, Chicago. 1990:76-97. 5. Holland MM, Fisher DL, Mitchell LG, Rodriguez WC, Canik JJ, Merril CR, Weedn VW. Mitochondrial DNA sequence analysis of human skeletal remains: identification of remains from the Viet Nam war. J Forensic Sci 1993; 38:542-553. 6. Wilson MR, DiZinno JA, Polanskey D, Replogle J, Budowle B. Validation of Mitochondrial DNA sequencing for forensic casework analysis. Int J Legal Med 1995;108:68-74. 7. La Rosa G, Robaina R. Infanticidio y costumbres funerarias en aborigenes de Cuba. Multigraf, La Habana, 1994. 8. Sensabaugh GF, Blake ET. DNA analysis in biological evidence: Applications of the polymerase chian reaction. in: Saferstein R, editor. Forensic Science Handbook III. Regents/Prentice Hall, New Jersey 1993:416- 452. 9. Wilson MR, Polanskey D, Butler J, DiZinno JA, Replogle J, Budowle B. Extraction, PCR amplification and sequencing of mitochondrial DNA from human hair shafts. Biotechniques 1995; 18: 62-669. 10. Graham DE. The isolation of high molecular weight DNA from whole organisms or large tissue masses. Analyt Biochem 1978;85:609-613. 11. Paabo S, Gifford JA, Wilson AC. Mitochondrial DNA sequences from a 7 000-years-old brain. Nucl Acid Res 1988;16:9775-9789. 12. Hagelberg E, Clegg JB. Isolation and characterization of DNA from archaeological bone. Proc R Soc Lond B 1991;244: 45-50. 13. Hochmeister MN, Budowle B, Borer UV, Eggmann U, Comey CT, Dirnhofer R. Typing of deoxyribonucleic acid (DNA) extracted from compact bone from human remains. J of Forensic Sciences 1991;36:1649-1661. 14. Corach D, Penacino G, Sala A. Cadaveric DNA extraction protocol based on cetyl trimethyl amonium bromide (CTAB). Acta Medicinae Legalis 1994;35-36. 15. Hagelberg E, Hedges R. Ancient bone DNA amplified. Nature 1989;342:485.Robertson JM, Sgueglia JB, Badger CA, Juston AC, Ballantyne J. Forensic applications of a rapid, sensitive, and precise multiplex analysis of the four short tandem repeat loci HUMVWF13/A, HUMTH01, HUMF13A01, and HUMFES/FPS. Electrophoresis 1995;16: 1568-1576. Copyright 1998 Elfos Scientiae The following images related to this document are available:Photo images[ba98004a.jpg] [ba98004d.jpg] [ba98004b.jpg] [ba98004c.jpg] |
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