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ESTUDIO COMPARATIVO MEDIANTE DIFERENTES SOLUCIONES PARA ELUIR EL INTERFERON ALFA RECOMBINANTE DE UNA COLUMNA DE INMUNOAFINIDAD Jose R Hernandez,^1 _ Miriela Gil,^2 Yai Cruz,^1 Rebeca Bouyon,^1 Jorge Segredo^2 y Lorenzo Rodes^2
^1 Division de Produccion de Interferones;
Recibido en mayo de 1997. Aprobado en junio de 1997.
Code Number: BA98005
ABSTRACT Three solutions were tested to elute the recombinant human alpha 2b interferon (IFN), from an affinity column containing monoclonal antibodies CB IFN 2.4: 1) glycine NaCl - HCl, 2) acetic acid - NaCl and 3) urea NaCl acetic acid. The best performance was obtained with the solution containing urea. The protein was eluted at a higher pH with a higher resolution process and a recovery of the product 18 % greater than the HCl - glycine solution. The presence of urea at low concentrations in the elution modified the antigen-antibody interaction and avoided the aggregation between the IFN molecules. This allowed to concentrate the resulting IFN solution to values greater than 1.5 mg/mL without precipitation of the protein. Key words: recombinant alpha IFN, elution, IFN, immunoaffinity chromatography RESUMEN Para eluir el interferon (IFN) alfa 2b humano recombinante, adsorbido a una columna de inmunoafinidad cargada con anticuerpos monoclonales CB IFN 2.4, se usaron 3 soluciones: 1) glicina NaCl - HCl; 2) acido acetico - NaCl y 3) urea NaCl - acido acetico. Los mejores resultados se obtuvieron con la solucion urea - NaCl - acido acetico, en la cual el IFN fue eluido de la columna a un pH mayor, sin perdida en la resolucion del proceso y con un incremento del 18 % de la recuperacion del producto. La presencia de urea a bajas concentraciones en la solucion de elucion modifico el nivel de la interaccion antigeno-anticuerpo y evito la agregacion entre las moleculas de IFN; ello permitio concentrar los eluatos hasta valores superiores a 1,5 mg/mL sin observarse precipitacion. Palabras claves: interferon alpha recombinante, elucion, IFN, cromatografia de inmunoafinidad Introduccion Los interferones (IFN) alfa son proteinas de valor terapeutico por su actividad antitumoral, antiviral e inmunorreguladora (1). La expresion del IFN alfa 2b humano recombinante en Escherichia coli, a partir de la tecnologia del ADN recombinante, ha conducido a su obtencion en grandes cantidades con un alto nivel de pureza, y ha permitido que se aplique de manera eficaz en el tratamiento de diversas afecciones (2). La preparacion con una calidad adecuada para su uso clinico, a partir de materiales crudos, requiere de diferentes pasos de purificacion. Desde su descubrimiento por Isaacs y Linderman (1), hasta la actualidad, los procedimientos para la purificacion del IFN han evolucionado y comprenden tanto tecnicas convencionales como la cromatografia de inmunoafinidad mediante anticuerpos monoclonales (AcM) (3-6). Este tipo de cromatografia es muy usada para la purificacion de moleculas biologicas complementarias que pueden interactuar especifica y reversiblemente unas con otras, tales como antigeno y anticuerpo, enzima y sustrato y hormona y receptor. La purificacion del IFN alfa natural leucocitario con AcM se realizo por primera vez en 1978 (7) y, en 1981, se utilizo en la purificacion del recombinante (8). El desarrollo de esta tecnica facilito los procesos de purificacion a gran escala.
La seleccion de las condiciones que se emplean en la etapa de elucion durante la cromatografia de inmunoafinidad depende del grado de fortaleza de las interacciones antigeno-anticuerpo (Ag-Ac) y de las caracteristicas propias del antigeno que se desea purificar. Estas interacciones se denominan covalentes, entre las que se encuentran: las hidrofobicas, las de enlace ionico, las de puente de hidrogeno y las de fuerzas de Van der Waals (9).
El metodo tipico utilizado para la disociacion del complejo Ag-Ac en este tipo de cromatografia es el cambio de pH en la fase movil (10-12), combinado con el uso de reactivos como el tiocianato de potasio y el cloruro de sodio, los cuales inducen la desnaturalizacion reversible de las proteinas. En ocasiones, debido a la fuerte interaccion del complejo Ag-Ac, es necesario usar reactivos como la urea y el cloruro de guanidina a concentraciones elevadas. Estas drasticas condiciones de elucion, en muchos casos, desnaturalizan las moleculas purificadas y desactivan el ligando de afinidad (13).
En este trabajo se analiza el uso de urea a bajas concentraciones en la elucion de IFN a partir de una columna cargada con un gel de afinidad con AcM anti-IFN, comparandola con otros sistemas de elucion reportados. Materiales y Metodos Equipamiento cromatografico Se utilizaron una bomba peristaltica modelo 2232, un monitor UV modelo 2238, un registrador modelo 2210 y una columna XK 16/20, todos de Pharmacia Biotech (Uppsala, Suecia). Reactivos Todos los reactivos empleados eran de calidad analitica (Merck, Darmstadt, RFA). Inmunopurificacion El material filtrado en un volumen de 47 mL que contenia el IFN renaturalizado (14) a una concentracion de 50 ug/mL fue bombeado a una columna (XK 16/20), empacada con 5 mL de Sefarosa CL 4B, activada con CNBr y que tenia acoplado AcM del tipo CB-IFN A 2.4, con una capacidad de 0,5 mg de IFN por mililitro de gel (15) (suministrada por el departamento de matrices cromatograficas del Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia, CIGB). La columna se equilibro con 25 mL de PBS pH 7,2 a un flujo de 1,67 mL/min. Este flujo se mantuvo constante en todos los pasos del proceso de separacion. Despues de aplicada la muestra, el gel se lavo con 60 mL de PBS-NaCl pH 7,2. El IFN fue desorbido de la columna usando tres soluciones:
. Solucion de elucion 2 (NaCl 0,2 M) . Solucion de elucion 3 (urea 0,5 M-NaCl 0,2 M)
Las soluciones se ajustaron a pH 2,3; 2,8 y 3,1. Para la solucion 1 se utilizo acido clorhidrico y para las soluciones 2 y 3 acido acetico. La solucion 3 se ajusto ademas a pH 3,5 con acido acetico. El eluato de afinidad se concentro 7 veces en un sistema de ultrafiltracion de membrana plana (USA) usando una membrana YM 10. El concentrado se ajusto a pH 4,8 con NaOH 2 M. La proteina precipitada se separo filtrando el material por membrana de acetato de celulosa 0,2 um (Sartorius, Alemania).
La fraccion no eluida de la columna se determino por la diferencia entre la cantidad de IFN que se adsorbe al gel y la cantidad eluida para cada sistema de elucion. Para la desorcion de esta fraccion, una vez concluido el proceso cromatografico con cada una de las variantes, se lavo la columna con la solucion 1 a pH 2,3. Segun experimentos previos se conoce que todo el IFN adsorbido a la columna eluye con esta solucion (15).
La capacidad de purificacion de la matriz fue expresada como la masa de IFN que se retiene especificamente en el inmunoadsorbente. Tecnicas analiticas La concentracion de IFN en los eluatos, asi como en los lavados de las columnas se determino por el metodo de Lowry et al. (16). La concentracion de IFN en el extracto renaturalizado y filtrado, asi como en el material no adsorbido, se determino por un sistema ELISA disenado tipo sandwich, con 2 AcM con epitopes diferentes [AcM de captura CB alfa-IFN 2,3 (CIGB) y AcM de revelado CB alfa-IFN 2,4-POX (CIGB)] (17). El reconocimiento de la proteina se detecto por marcaje enzimatico. Resultados y Discusion Para los 3 sistemas estudiados a pH 2,3, la fraccion no eluida fue cero (Tabla 1), o sea, todo el IFN que se adsorbio al gel fue eluido, por lo cual no afecto la capacidad de desorcion ni el perfil de elucion de la columna de inmunoafinidad. En la Figura 1 se muestra el perfil cromatografico del proceso de inmunopurificacion del IFN con la solucion 1. Para las soluciones 2 y 3 el comportamiento fue similar.
Tabla 1. Resumen del proceso de purificacion a los pH 2,3; 2,8 y 3,1. En todos los casos la cantidad de IFN aplicado a la columna fue de 2,35 mg. Los resultados son el promedio de 5 corridas.
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Solucion Proteina eluida Recobrado IFN/Volumen de Fraccion no
(mg) Afinidad (%) gel (ug/mL) eluida (%)
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pH 2,3
1 2,01 86 402 0
2 2,1 89 420 0
3 1,29 55 258 0
pH 2,8
1 1,78 76 355 20
2 1,94 83 388 11
3 2,2 94 440 0
pH 3,1
1 1,75 74 350 22
2 1,81 77 362 16
3 2,16 92 432 0
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El aumento en el pH de 2,8 a 3,1 no provoco cambios en el perfil de elucion (la fraccion no eluida se mantuvo en 0 %) para el sistema 3, no asi para los sistemas 2 y 1, en los cuales la fraccion no eluida se incremento hasta 16 y 22 %, respectivamente. Los resultados obtenidos con el sistema 3 en comparacion con los sistemas 2 y 1 confirman la observacion anterior del efecto que tiene este agente en la disociacion del complejo Ag-Ac. En la mayoria de los sistemas de afinidad fundamentalmente en aquellos donde prevalecen las interacciones tipo enlace de hidrogeno y van der Waals la disociacion se alcanza con un decrecimiento del pH del medio acuoso; sin embargo, en los sistemas Ag-Ac en los cuales existen ademas enlaces de tipo hidrofobicos y electrostaticos, la disociacion se ve favorecida con el uso de aditivos como la urea (8). Es caracteristico en el proceso posterior a la inmunopurificacion, que al aumentar la concentracion de proteinas en la solucion de elucion se formen agregados moleculares que precipitan. Esta tendencia se acentua durante el proceso de ajuste a pH 4,8, En nuestro estudio se lograron resultados favorables con el sistema 3, donde los eluatos obtenidos fueron concentrados hasta 1,77 mg/mL para pH 2,8 y hasta 1,57 mg/mL para pH 3,1, sin que se detectara precipitacion. Para los otros dos sistemas estudiados, se observo precipitacion a partir de valores superiores a 0,6 mg/mL. Todo el IFN purificado por este sistema se estimo con un grado de pureza superior al 95 % por electroforesis en gel de poliacrilamida (datos no mostrados).
La aplicacion de la solucion 3 con urea (pH 3,1) aporta resultados de marcado interes practico. Al poder desorber y concentrar la proteina a un pH mayor, esta se somete a cambios menos drasticos, lo cual repercute en el incremento del nivel de estabilidad del inmunoadsorbente. Los AcM, al encontrarse sometidos a condiciones de explotacion mas favorables para la retencion de su actividad especifica, prolongan su tiempo de vida util. En efecto, los niveles de purificacion obtenidos con el inmunoadsorbente utilizado para la elucion con el sistema 3, se mantuvieron estables durante mas de 30 ciclos cromatograficos realizados a los pH 2,8; 3,1 y 3,5; no asi con los otros dos sistemas estudiados en los cuales se observo una disminucion en la capacidad de adsorcion de las columnas (Figura 3). Esta disminucion se ha reportado anteriormente para los geles de inmunoafinidad obtenidos por el metodo de activacion con bromuro de cianogeno en condiciones de elucion a pH inferiores a 3,1 (16).
Conclusiones La presencia de urea en la solucion de elucion mejora sensiblemente el proceso de inmunopurificacion de IFN y contribuye al incremento de los niveles de recuperacion hasta un 18 % mas con respecto a los sistemas de elucion usualmente empleados y permite concentrar el IFN a valores superiores a 1,5 mg/mL. En primer lugar modifica el nivel de la interaccion Ag-Ac (disminuyendola) y, en segundo lugar, al solvatar las proteinas contribuye de manera eficaz a evitar la agregacion entre las moleculas de IFN. References 1. Issacs A, Linderman J. Virus interference. Proc Soc London Ser B 1957;147: 58-267. 2. Nagata S, Taira H, Hall A, Jhonsrud L, Streuli M, Escodi J et al. Synthesis in E. coli of a polypeptide with human leukocyte interferon activity. Nature 1980; 284:316-320. 3. Rubinstein M, Rubinstein S, Familletti P, Gross MS, Waldman A, Pestka S. Human leukocyte interferon purified to homogeneity. Science 1978;202:1289-1290. 4. Knight E. Purification of interferon. Pharmac Ther A 1978;2:439-446. 5. Hsiang-Fu K, Yu-ching E, Moschera J, Tsai K, Bekesi E, Chang M et al. Purification of recombinant human immune interferon. Methods in Enzymology 1986; 119:204-210. 5. Berg K, Heron I, Halmiton R. Purification of human interferon by antibody affinity chromatography using highly adsorbed anti-interferon. Scand J Immunol 1978;8:429-436. 7. Levy W, Rubinstein M, Shively J, del Valle U, Lai C, Moschera J et al. Amino acid sequence of a human leucocyte interferon. Proc Natl Acad Sci 1981; 8:6186-6190. 8. Staehlin T, Hobbs D, Hsiangfu H, Lai C, Pestka S. Purification and characterization of recombinant human leucocity interferon with monoclonal antibodies. J Biol Chem 1981;256:9750-9754. 9. Van Oss C, Good R, Chaudhury M. Nature of the antigen-antibody interaction. J of Chromatog 1986;376:111-119. 10. Meurs E, Laurent A, Suab J, Montagnier L. Purification of human leucocyte interferon to homogeneity with the use of a monoclonal antibody: detailed technique and parameters. Ann Virol (Inst. Pasteur) 1983;134E:361- 374. 11. Tarnowski S, Roy S, Liptak R, Lee D, Ning R. Large scale purification of recombinant human leukocyte interferons. Methods in Enzymology 1986;119:153-165. 12. Axen R, Porath J, Ernback S. Chemical coupling of peptides and proteins to polisacharides by means of cyanogen halides. Nature 1967;214:1302- 1304. 13. Ernst-Cabrera K, Wilchek M. Immunoaffinity chromatography and its application for the purification of pharmaceutically active proteins. Med Sci Res 1988;16:305-310. 14. Quinones Y, Agraz A, Silva A, Padron G, Mella C, Diaz R et al. High purity recombinant human alpha-2 interferon free from oligomeric forms in E. coli. Highlights Modern Biochemistry 1989;2:1237- 1246. 15.Hernandez J, Segredo J, Perez E, Canaan-Haden L, Saez V, Rodes L. Inmunoadsorbentes con capacidad de purificacion incrementada basados en el recubrimiento de agarosa con polietilenimina. Biotecnologia Aplicada 1994; 11:236-240. 16. Lowry O, Rosenbrough N, Farr A, Randall R. Protein measurement with the Folin-Phenol Reagent. J Biol Chem 1951; 193:265-269. 17. Perez E, Perez L, Maranon V, Mella C. Tratamientos analiticos de muestras de IFN alfa 2b h. rec. para su cuantificacion por ELISA. Biotecnologia Aplicada 1991;8:392-399. Copyright 1998 Elfos Scientiae The following images related to this document are available:Line drawing images[ba98005c.gif] [ba98005b.gif] [ba98005d.gif] [ba98005a.gif] |
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