 |
| About Bioline | All Journals | Testimonials | Membership | News |
|
||||||
|
||||||
Biotecnología Aplicada 1998;15:176-179 ESTUDIO DEL EFECTO DE DIFERENTES VARIABLES PARA LA OPTIMIZACIÓN DEL PROCESO DE PURIFICACIÓN DEL INTERFERÓN GAMMA HUMANO RECOMBINANTE Gustavo Furrazola, * Rebeca Bouyón, Roger Moya, Abel Domínguez y Yaí Cruz División de Producción de Interferones. Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología, apartado postal 6162, CP 10600, Ciudad de La Habana, Cuba. Telef: (53-7) 21 6022; Fax: (53-7) 21 8070; Telex: INGENCU 512330; E-mail: ifn@cigb.edu.cu Recibido en noviembre de 1997. Aprobado en marzo de 1998.
Code Number: BA98028
ABSTRACT Some variables of the purification process for recombinant human gamma interferon (rec-hum g IFN) were studied in order to search for a more economic process that may increase the productive capacities of this protein. The reduction of the ionic strength in the renaturation process allowed a recovery of rec-hum g IFN 1.82 times higher in this step as well as a higher stability of the protein under this condition. A new matrix, Fractogel EMD 650 SO3- (S) was evaluated in the ionic exchange chromatography and the working parameters were established. A better recovery and reproducibility were achieved with a column charge of 10 mg of protein per miligrame of resin and stepwise gradient at 0.46 - 0.49 M NaCl in this step. The use of lower ionic strength (0.01 M) showed no differences in the results obtained and at lower pH values there was an increase in the recovery of IFN, until a value close to 50 % for this step. The use of the more economic ion exchange matrix and the best conditions found in this study allowed a higher recovery in the purification step and at the same time to own a final product with higher stability and similar quality attributes. Key words: chromatography, renaturation, recombinant gamma interferon, purification RESUMEN Se realizó un estudio de diferentes variables en el proceso de purificación del interferón gamma humano recombinante (IFN g hu-r) con vistas a obtener un proceso de purificación más económico, el cual posibilite el incremento de las capacidades productivas de esta proteína. Con la disminución de la fuerza iónica en la renaturalización de 0,1 M a 0,01 M se logró un aumento del recobrado en el paso de 1,82 veces y la proteína mostró ser más soluble bajo estas condiciones. Se evaluó la matriz de intercambio catiónico Fractogel EMD 650 SO3- (S) y se establecieron los parámetros de trabajo. Se obtuvo un mejor recobrado y reproducibilidad a una carga de 10 mg/mL de gel y gradiente escalonado entre 0,46 y 0,49 M de NaCL. Una fuerza iónica inferior (0,01 M) no mostró diferencias en los resultados y la disminución del pH produjo un aumento del recobrado, hasta un valor cercano al 50 % para este paso. Con la utilización de una matriz de intercambio iónico menos costosa y el empleo de las mejores condiciones estudiadas en la etapa de purificación, se logró incrementar el recobrado de la misma y se obtuvo un producto con una mayor estabilidad e igual calidad. Palabras claves: cromatografía, renaturalización, interferón gamma recombinante, purificación Introducción La producción de los interferones (IFN) a través de la tecnología del ADN recombinante ha permitido la obtención de grandes cantidades de estos productos con un alto nivel de pureza. La importancia del estudio y la producción de estas moléculas reside en sus propiedades antivirales, inhibidoras del crecimiento celular e inmunomoduladoras, las cuales las convierten en una herramienta en el tratamiento de diferentes afecciones (1, 2). El IFN gamma humano recombinante (IFN g hu-r) ha sido expresado en Escherichia coli de forma insoluble (3, 4). Esta proteína es una molécula dimérica, en su forma activa, cada monómero está constituído por 144 aminoácidos, posee un alto punto isoeléctrico (proteína básica) y la misma presenta una alta tendencia a la agregación y a la degradación por proteasas en el extremo C-terminal (4, 5). La renaturalización constituye la etapa determinante en el recobrado de proteínas insolubles, este trabajo tiene como primer objetivo el mejoramiento de este paso. El recobrado alcanzado en este proceso ha sido menor de un 50 %, debido a que el mismo compite con la agregación y precipitación irreversible de la proteína. La etapa de intercambio iónico es a su vez el paso cromatográfico fundamental pues en este se eliminan proteínas contaminantes, así como IFN g degradado lo que determina la pureza final del producto. La matriz empleada en esta etapa ha sido la MONO S (Pharmacia) (3), una matriz de alta resolución la cual ha mostrado un buen desempeño en el proceso, pero a un costo elevado. En el presente trabajo se evalúa la matriz Fractogel EMD 650 SO3- (S) (Merck) con vistas a lograr un producto con las mismas características y calidad obtenidas anteriormente a menor costo. Materiales y Métodos Todos los reactivos utilizados son de grado analítico. Los tampones fueron preparados con agua purificada (Super Q, Millipore) y filtrados por membrana microbiológica de 0,2 m m (Sartorius). Renaturalización El IFN g hu-r desnaturalizado, en solución TE-GuHCL 4 M, es renaturalizado por medio de un proceso de desalinización en una columna K 50/60 (Pharmacia) empacada con gel Sephadex G-25 (Medium, Pharmacia). La proteína es aplicada a la columna a una concentración de 0,8 mg/mL. La solución empleada en la renaturalización fue acetato de amonio (0,1 M o 0,01 M) + 5 % sacarosa, pH 7,2 a una velocidad lineal promedio de 41,5 cm/h. Intercambio iónico Los experimentos se realizaron en un sistema FPLC (Pharmacia) acoplado a una computadora con el software BIOCROM (CIGB, Cuba) (6) para registrar y almacenar los datos del proceso. Se empleó una columna HR 5/5 (Pharmacia) con un contenido de 1 mL de gel Fractogel EMD 650 SO3- (S) (Merck). La proteína fue aplicada a una velocidad lineal de 150 cm/h disuelta en acetato de amonio (0,1 o 0,01 M) + 5 % sacarosa (Solución A, tampón de equilibrio) y eluida a través de un gradiente lineal con Solución B (Solución A+ NaCl 1 M) en 60 min. Se probaron cuatro condiciones de pH: 7,2; 6,5; 6,0 y 5,5. El pH se reguló añadiendo hidróxido de amonio o ácido acético según el valor de pH requerido. El producto eluido de la columna se colectó en fracciones que fueron analizadas por electroforesis para chequear su pureza. Se tomaron las fracciones puras (sin degradación) y se mezclaron. Métodos analíticos La concentración de proteínas fue determinada por el método de Lowry (7) y la pureza por electroforesis en gel de poliacrilamida al 15 % en presencia de SDS (EGPA-SDS) (8). Se utilizó el método de tinción con plata para la detección de las proteínas (9). La determinación de la actividad biológica del IFN g hu-r en las muestras se realizó midiendo la inhibición del efecto citopatogénico ejercida por este sobre células HEP-2 empleando el virus Mengo. Se utilizó un estándar internacional de IFN g (Gg 23-901-530). La pureza del IFN g hu-r se verificó además por cromatografía de RP-HPLC, empleando una columna C8 de 4,6 x 100 mm (Bakerbond, JT Baker) y un gradiente lineal de 15 a 60 % de B en 40 min. La composición del sistema de solventes empleado fue:
Resultados y Discusión Estudios de renaturalización con variación de la fuerza iónica En la Tabla 1 se muestran los resultados obtenidos en la renaturalización empleando las dos soluciones con diferente fuerza iónica: acetato de amonio 0,1 y 0,01 M-5 % de sacarosa, pH 7,2 (los resultados son el valor promedio obtenido de tres corridas). Como se puede observar, el recobrado de proteínas a menor fuerza iónica es 1,82 veces superior que el obtenido con la otra variante; de este modo se logró un material con mayor calidad, en cuanto a sus características organolépticas. Este hecho representa una mejora importante, puesto que la precipitación de proteínas representa un inconveniente serio durante la filtración por membrana (0,2 m m), la cual se realiza antes de la siguiente etapa, así como por la afectación en el tiempo de vida de las columnas y el recobrado del proceso que dependen de la calidad del material aplicado. La actividad específica del renaturalizado para ambos casos es similar, lo que indica que el mismo no se ha visto afectado con la disminución de la fuerza iónica del medio. El material obtenido en este paso posee un alto grado de pureza (Figura 1, línea 1). Figura 1. Electroforesis en gel de poliacrilamida al 15 %. Línea 1: material renaturalizado (aplicado a la columna de intercambio iónico); línea 2: eluato de intercambio iónico y línea 3: material de referencia. Tabla 1. Renaturalización del IFN g empleando dos condiciones de fuerza iónica.
Se estudió la solubilidad del material renaturalizado en solución a 4 ºC, bajo las dos condiciones empleadas, hasta cinco días de almacenamiento posteriores a la fecha de realización del proceso (datos no mostrados). La pérdida por precipitación en el material procesado a mayor fuerza iónica fue de un 68 %; en el otro caso fue de sólo un 33 %. La alta tendencia a la agregación de esta proteína durante la renaturalización ha sido previamente demostrada (10). Se ha observado que al renaturalizar IFN g hu-r a partir de una solución de urea 7 M, por dilución, se obtienen dos formas en solución, las cuales difieren en tamaño y actividad biológica; ambas no se encuentran en un equilibrio rápido reversible. Estas formas representan moléculas plegadas de diferente forma y la proporción de las mismas, obtenida después de la renaturalización, está influenciada por la concentración de proteínas y la fuerza iónica del tampón empleado en dicho proceso (10). En nuestro caso, el efecto de la fuerza iónica del medio sobre el estado de plegamiento y/o agregación de la molécula, observada por otros investigadores, también explica los resultados obtenidos con las condiciones empleadas. Evaluación de la matriz de intercambio iónico Estudio del gradiente de elución. Se estudió la influencia del gradiente escalonado en el recobrado y la reproducibilidad del perfil cromatográfico, para ello se realizaron escalones entre 46-49 % de B (acetato de amonio 0,1 M, 5 % sacarosa + NaCl 1 M, pH 7,2). En este rango se logra la separación entre el pico correspondiente al IFN degradado del pico correspondiente al IFN puro, el cual comienza a eluir aproximadamente entre un 53-55 % de B (Figura 2). Figura 2. Perfil cromatográfico obtenido con gradiente de elución escalonado, pH 7,2; 0,1 M de NH4Ac y carga 10 mg/mL de gel. 1: IFN degradado; 2: IFN nativo. Al analizar la pureza se obtuvo que en la primera fracción del pico de IFN existe un pequeño por ciento de IFN degradado, por lo que aún logrando una buena resolución, es recomendable utilizar la electroforesis como criterio de pureza antes de mezclar las fracciones del pico de IFN puro. Con la utilización del escalón, se logró una reproducibilidad en el perfil cromatográfico y la presencia de IFN degradado se limita a la primera fracción del pico de IFN puro. Capacidad de carga. Con el objetivo de definir la capacidad de carga más adecuada para esta matriz, se realizaron corridas empleando tres condiciones: 10, 20 y 30 mg de proteína por mililitro de gel. Los resultados se muestran en la Tabla 2 (los resultados son el valor promedio obtenido de tres corridas). Tabla 2. Efecto de la carga de muestra aplicada a la columna en el recobrado del proceso.
Una carga superior a 10 mg/mL de gel produce una disminución en el recobrado de IFN debido fundamentalmente a pérdidas por proteína no enlazada a la matriz así como se afecta su resolución. La disminución de la resolución de la matriz se muestra en las Figuras 3 A, B y C; para la carga máxima (30 mg/mL) se obtiene un sobrelapamiento casi total entre el pico de proteína degradada (pico 1) y el pico principal de IFN (pico 2). Las fracciones del pico principal de IFN g hu-r obtenidas de la corrida realizada a carga 10 mg/mL, analizadas por EGPA-SDS se observan en la Figura 4. En las primeras fracciones se aprecia una banda de IFN degradado asociado a la molécula intacta. En la Figura 1 se muestra un material aplicado en el paso de intercambio iónico (renaturalizado), un eluato de intercambio iónico (mezcla de fracciones que contienen el IFN g hu-r puro) y un material de referencia aplicados en una EGPA-SDS; como se puede apreciar, el material eluido presenta una alta pureza. Figura 3. Perfil cromatográfico obtenido con gradiente de elución lineal, pH 7,2; 0,1 M de NH4Ac y carga: a) 10 mg de IFN/mL de gel, Figura 3. b) 20 mg de IFN/mL de gel y Figura 3 c) 30 mg de IFN/mL de gel. Pico 1: IFN degradado; pico 2: IFN nativo. Figura 4. Electroforesis en gel de poliacrilamida al 15 %. Línea 1: patrón de peso molecular; líneas 2-5: fracciones de la 1 a la 4 eluidas de la columna de intercambio iónico y línea 6: patrón de IFN g hu-r. Estudio de la influencia del pH y la fuerza iónica. Se probaron igualmente las dos condiciones de fuerza iónica en esta etapa del proceso: acetato de amonio 0,1 y 0,01 M-5 % de sacarosa, pH 7,2. No se obtuvieron diferencias en cuanto al recobrado de IFN ni variación en los perfiles cromatográficos al comparar ambas variantes (resultados no mostrados). En relación con la variación en el pH de las soluciones, los resultados se muestran en la Figura 5. Para ambas variantes de fuerza iónica se observa un aumento en el recobrado de IFN con la disminución del pH. Figura 5. Influencia del pH y la fuerza iónica del tampón en el recobrado de IFN gamma en la cromatografía de intercambio iónico. El IFN g hu-r es una proteína básica, con un punto isoeléctrico igual a 8,2, el cual fue determinado experimentalmente (11). Es conocido que la solubilidad de las proteínas es generalmente mínima en la región cercana a su punto isoeléctrico y se incrementa sustancialmente al alejarnos hacia un pH más ácido o más básico (12). La disminución del pH de la solución provoca que la molécula adquiera una carga positiva mayor; con ello se fortalece la interacción entre la matriz y la proteína y esto haría también disminuir la agregación de la misma. De acuerdo con los resultados obtenidos por otros investigadores (13) se ha propuesto que al moverse de pH 5 a pH 6, los cambios electrostáticos de la molécula de IFN g hacen que aumente la estabilidad termodinámica de esta (lo cual significa que se necesita más energía para su desnaturalización) pero a la misma vez, la pérdida de carga positiva (posiblemente por la deprotonación de las histidinas), produce un cambio dramático en las propiedades de solubilidad; ello la hace más susceptible a la agregación (13). Los mejores resultados se obtuvieron con la variante de intercambio iónico realizada a menor fuerza iónica y pH 5,5. En la Figura 6 se muestra que la pureza del producto analizada por RP-HPLC fue superior a 97 %. Figura 6. Determinación de la pureza por RP-HPLC al producto final obtenido por cromatografía de intercambio iónico a una fuerza iónica de 0,01 M de acetato de amonio-5 % de sacarosa, pH 5,5. Los resultados de los parámetros de calidad obtenidos para la proteína producida con la nueva variante (menor fuerza iónica) son mostrados en la Tabla 3. Los mismos son semejantes a los obtenidos normalmente en la producción; con ello se evidencia la alta calidad del material purificado. Tabla 3. Controles de calidad realizados al producto final.
Como conclusiones de este trabajo se puede afirmar que la disminución de la fuerza iónica en el paso de renaturalización permitió aumentar el recobrado de esta etapa y contar con un material más estable y de Tabla 3. Controles de calidad realizados al producto final mayor calidad para las operaciones cromatográficas. Con el empleo de la matriz Fractogel EMD 650 SO3- se logró un material que cumple con los parámetros de calidad establecidos para esta proteína, empleando un gel de menor costo. En su conjunto, con estas mejoras, es posible contar con un proceso más económico, lo cual permitirá un aumento en las capacidades productivas de esta proteína de interés terapéutico. Referencias
Copyright 1998 Elfos Scientiae The following images related to this document are available:Photo images[ba98028a.jpg] [ba98028f.jpg]Line drawing images[ba98028g.gif] [ba98028c.gif] [ba98028h.gif] [ba98028e.gif] [ba98028d.gif] [ba98028b.gif] |
| |||||||||
