Biotecnologia Aplicada Elfos Scientiae ISSN: 0684-4551 Vol. 16, Num. 2, 1999

@ Juan P Martínez-Soriano,1 Norma E Leyva-López,1 María E Zavala-Soto,1
Marie Bères,2 Diana S Leal-Klevezas3

1Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional.
Unidad de Biotecnología e Ingeniería Genética de Plantas. AP 629, Irapuato, Gto. México.
E-mail: jpms@irapuato.ira.cinvestav.mx
2Institut National Agronomique Paris-Grignon. 16, rue Claude Bernard 75231 Paris Cedex 05, Francia.
3Centro de Investigación Biomédica del Noreste, Instituto Mexicano del Seguro Social.
San Luis Potosí y 2 de abril, Colonia Independencia, Monterrey, NL México.

Economic losses due to the potato diseases caused by phytoplasmas are of considerable value in Mexico (up to 100% in some cases). "Punta morada" and "bola de hilo" (local names meaning "purple top" and "ball of twine", respectively) are the main syndromes observed in the field. The latter is one of particular interest among potato seed producers because it affects tuber germination when infected tubers are used as seed. Because phytoplasmas cannot be cultured in vitro and their detection by visual inspection, by serological methods or by electron microscopy is inefficient and performed late during disease development, disease eradication is an impossible task. In this report, PCR was used as a new tool to detect early or latent phytoplasma infections in symptomless potato "seeds", which will eventually produce "hair sprouts".

Keywords: diagnosis, mycoplasma-like organisms, PCR, phytoplasmas

Introducción

El cultivo de la papa es uno de los más importantes de la República Mexicana. La Confederación de Productores de Papa de México (CONPAPA) reportó, en 1996, una superficie de 72 450 ha sembrada con este importante cultivo. De la inversión total, aproximadamente 40% (cerca de 200 millones de dólares estadounidenses) se destina a la adquisición de tubérculos que se usarán como semilla. Por tal motivo, los daños o pérdidas que incidan directamente sobre las semillas son realmente desastrosos.

En los últimos años, el cultivo de la papa se ha visto afectado notablemente por las enfermedades conocidas, por su sintomatología, como "punta morada" y "bola de hilo". Se tienen evidencias de que una especie del género Phytoplasma, cuyos miembros se conocían anteriormente como organismos de tipo micoplasma (OTM), es el agente causal de estos síndromes y es transmitido por un insecto vector.

De estos síndromes, "bola de hilo" ha causado los mayores estragos recientemente, al pasar inadvertido en tubérculos aparentemente sanos que no germinan o lo hacen muy pobremente cuando son usados como semilla [1]. El síntoma característico es la brotación de tallos extremadamente débiles, deficientes en clorofila, que dan la apariencia de hilos blancos típicos de la enfermedad (Figura 1). Estos débiles brotes se necrosan finalmente y la semilla muere. Peor aún, en algunos casos como el que muestra la fotografía, algunos brotes aparentemente sanos permiten la "nascencia" de una planta que pudiera parecer sana; sin embargo, continuará infectada y servirá como inóculo primario para la dispersión por insectos vectores. Estas plantas aparentemente sanas redituarán tubérculos infectados otra vez, que no germinarán (o lo harán de forma deficiente) si son usados como semilla.

Cadena-Hinojosa señala incidencias de 6% en Zamora Michoacán e indica también que en el Valle de México las siembras tempranas (mediados de marzo) presentaron incidencias muy altas en 1971 [2]. Para el estado de Guanajuato, García-Quijano menciona que de 1993 a 1994, el porcentaje de tubérculos dañados como consecuencia de esta enfermedad aumentó de 30 a 60%, con un alto impacto económico negativo [3]. Sin embargo, la incidencia ha llegado a niveles tan altos como 80% de los tubérculos utilizados como semilla (Romero y Villaverde 1997).

A pesar de que la principal forma de transmisión de la enfermedad es mediante insectos vectores de la familia Cicadellidae, se ha calculado un alto por ciento de transmisión por semilla-tubérculo [4].

Un diagnóstico eficaz de las enfermedades cuando la detección eficiente y adecuada del patógeno se realiza a tiempo, permite establecer estrategias de control o erradicación al posibilitar la detección de los focos de infección. Sin embargo, este no es el caso de estas enfermedades, cuyo diagnóstico se basa, principalmente, en la observación de la sintomatología. El control de la enfermedad es ineficiente debido a la fácil diseminación del patógeno por insectos o tubérculos asintomáticos [1, 5]. Este método es tardío y no confiable debido a que los síndromes "punta morada" y "bola de hilo" de la papa pueden confundirse con otras enfermedades infecciosas y algunas deficiencias nutricionales; en consecuencia, el diagnóstico basado en la sintomatología requiere la confirmación de la presencia del fitoplasma en el floema de la planta enferma.

La identificación de los fitoplasmas y su clasificación en grupos, se basa en características biológicas como la especificidad de transmisión por insectos vectores, el rango de hospedero y el tipo de síntomas, por lo que, según Lee y colaboradores, a estos organismos sólo se les conoce por los síntomas que inducen en el hospedero [6].

No obstante las diferentes técnicas que se han empleado para el diagnóstico de enfermedades causadas por fitoplasmas, la falta de habilidad para aislar y cultivar artificialmente estos organismos ha impedido por mucho tiempo el desarrollo de un método eficiente y confiable para su detección e identificación [7].

La microscopía electrónica y el marcaje del ADN con DAPI (4,6-diamidina-2-fenilindol•2HCl), en conjunción con la microscopía de fluorescencia, han sido usados como herramientas alternativas para la detección de fitoplasmas que infectan a las plantas [8]. Sin embargo, aunque estos métodos pueden ser altamente sensibles, en algunos casos se reduce la sensibilidad debido a la baja concentración del patógeno en las plantas enfermas; además, estos métodos no proveen información acerca de la identidad del fitoplasma causante de la enfermedad. Aunado a lo anterior, estos procedimientos son caros, laboriosos, requieren de personal capacitado y el número de muestras procesables es realmente limitado.

La detección específica y sensible de algunos fitoplasmas, tanto en plantas como en insectos hospederos, también se ha logrado por medio de la hibridación molecular con sondas obtenidas a partir de fragmentos clonados al azar del ADN de fitoplasmas [9-11].

Sin embargo, con la introducción de la reacción en cadena de la polimerasa (RCP), se ha incrementado la sensibilidad y la especificidad en la detección de fitoplasmas, tanto en plantas como en insectos hospederos, con la superación de la baja de sensibilidad observada en la hibridación molecular cuando la concentración de los fitoplasmas en las muestras procesadas es baja [5, 12].

Este trabajo de investigación se planteó ante la expectativa de coadyuvar en la detección segura y eficiente del fitoplasma causante del síndrome "bola de hilo" de la papa, en su incorporación en las estrategias de control y manejo de la enfermedad en los programas de mejoramiento genético, en las medidas cuarentenarias y de certificación en el movimiento de material genético de la papa, y en estudios epidemiológicos.

Por lo anterior, este estudio tuvo como objetivos desarrollar e implementar una metodología de diagnóstico molecular eficiente y específica para la enfermedad "bola de hilo" de la papa basada en la RCP, que permitiera la detección del patógeno aun en plantas asintomáticas con una infeccción temprana o latente.

Materiales y Métodos

Las muestras de papa se colectaron en diferentes regiones afectadas por la enfermedad, en los estados mexicanos de Guanajuato, México y Coahuila. Los órganos de la planta colectados fueron: hojas maduras e inmaduras, tallo y, sobre todo, tubérculos y brotes. Las muestras se tomaron de plantas que mostraron los síntomas típicos del ataque del(os) patógeno(s). Además, se colectaron muestras de plantas asintomáticas.

Para la extracción del ADN total (incluye el ADN de la planta y del parásito], se utilizaron metodologías reportadas previamente [13, 14]. Se trituró un gramo de tejido fresco congelado con nitrógeno líquido en un mortero, la muestra macerada se transfirió a un tubo de centrífuga y se le agregó de 2 a 4 mL de solución de extracción 2-M/CTAB (CTAB 2% p/v; Tris-HCl 100 mM pH 8,0; EDTA 20 mM pH 8,0; NaCl 1,4 M; polivinil-pirrolidona 40 000 1% p/v; 2-mercaptoetanol 0,2% v/v) precalentada a 65 °C durante 30 min, con agitación suave a intervalos.

Al extracto se le agregó 1 volumen de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1), se mezcló por inversión y se centrifugó a 8 000 xg durante 5 min a 4 °C. Se extrajo la fase acuosa (sobrenadante) y se añadió un décimo del volumen de CTAB 10% (CTAB 10% p/v, NaCl 0,7 M). Se agregó 1 volumen de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1) y se centrifugó a 8 000 xg durante 5 min a 4 °C. Se extrajo la fase acuosa y se agregó 1 volumen de la solución de precipitación (CTAB 1% p/v, Tris-HCl 50 mM pH 8,0 y EDTA 10 mM pH 8,0), y se centrifugó durante 5 min a 2 000 xg a 4 °C.

El precipitado se resuspendió en un tampón con un alto contenido de sales (Tris-HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 0,1 mM pH 8,0, NaCl 1M), de 0,5 a 1,0 mL por gramo de muestra. Al ADN se le adicionaron 0,6 volúmenes de isopropanol, se mezcló por inversión y se centrifugó a 8 000 xg a 4 °C. La pastilla se lavó con etanol 80%, se secó y se resuspendió en tampón TE (Tris-HCl 10 mM pH 8,0 EDTA 1 mM pH 8,0, de 100 a 500 µL por gramo de muestra). A esta solución se le agregaron 0,5 volúmenes. de acetato de amonio 7,5 M, se dejó en hielo durante 10 min y se centrifugó a 10 000 xg durante 10 min. Se tomó la fase acuosa, el ADN se precipitó adicionando 0,6 volúmenes de isopropanol y se centrifugó a 10 000 xg por10 min. El ADN se lavó con etanol 70% frío (dos veces), se secó al vacío y se resuspendió en tampón TE (de 50 a 100 µL por gramo de muestra). La concentración del ADN se determinó en un espectrofotómetro, mediante la lectura de su absorbancia a 260 nm. La muestra se conservó a 4 °C hasta su procesamiento.

Para llevar a cabo la RCP, se utilizaron cebadores reportados por otros autores y otros diseñados en nuestro laboratorio, con el fin de aumentar la especificidad y la sensibilidad ensayo. Las secuencias nucleotídicas de los cebadores utilizados en este trabajo son [5, 12, 15, 16]:

5'-AAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATT-3'(P1),
5'-TCAGGCGTGTGCTCTAACCAGC-3'(tint),
5'-TCAGCAATGATTTTTCCATC-3'(MMR),
5'-ACGACTGCTGCTAAGACTGG-3'(R16F2)
5'-TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG-3'(R16R2)

Las reacciones en cadena de la polimerasa se realizaron en tubos Eppendorf de 0,5 mL, en un volumen total de la reacción de 50 µL, que contenía 50 ng de ADN, 25 pmol de cada cebador, tampón de RCP1X, MgCl2 2 mM, nucleósidos trifosfatados (dNTP) a 200 µM cada uno y 2,5 unidades de Taq ADN polimerasa (Perkin Elmer, Estados Unidos). Para evitar la evaporación del agua de la reacción, se añadieron 50 µL de aceite mineral.

Las RCP se realizaron en un termociclador (MJ Research) bajo condiciones iniciales seleccionadas de acuerdo con reportes previos [5, 12]. Sin embargo, las condiciones de reacción se ajustaron durante el desarrollo del trabajo. Se tomaron 8 µL de cada reacción y se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa 0,8% en tampón TBE 1X (Tris-HCl 100 mM, ácido bórico 90 mM, EDTA 1 mM), que contenía bromuro de etidio (0,5 mg/mL). El ADN se visualizó en una cámara de luz ultravioleta [17].

Resultados y Discusión

Se extrajo un ADN total de excelente calidad de diversos tejidos de, según su fraccionamiento en gel y su absorbancia. Los ADN se utilizaron en diversas pruebas de ajuste con los diversos cebadores. Se probaron los cebadores en RCP enfocadas hacia la detección de fragmentos específicos en el genoma de Phytoplasma spp. (Figura 2A), utilizando diversas condiciones y temperaturas de hibridación entre 50 y 60 °C. Las RCP intentadas permitieron la amplificación de fragmentos de 1 600, 466 y 332 pb (según los cebadores utilizados) en los tejidos infectados, lo que demuestra una amplificación específica para fitoplasmas (Figura 2B). Las amplificaciones truncadas o inespecíficas se eliminaron completamente cuando la temperatura de hibridación fue 60 °C.

Todas las plantas y tubérculos con síntomas fueron positivos según la reacción, sin embargo, es importante destacar que fue posible detectar el patógeno en tubérculos asintomáticos, pero que sin duda provenían de plantas infectadas. Esto se corroboró cuando se incubaron los tubérculos asintomáticos hasta la germinación/brotación, lo cual resultó en la aparición de "brotes de hilo" sólo en los tubérculos detectados por RCP como infectados por fitoplasmas. No se observó amplificación cuando se usaron como molde ADN testigos de tejidos de plantas sanas, con lo que se demostró la especificidad de los cebadores en la detección de fitoplasmas solamente (Figura 2B).

De forma comparativa, los cebadores conocidos como R16F2 y R16R2 diseñados en otros laboratorios [12], que se habían considerado universales, no redituaron resultados consistentes (bajo nuestras condiciones) y fallaron en el intento de detectar la presencia de los fitoplasmas en tubérculos infectados (Figura 2B).

 Dados estos resultados, es obvio que el diagnóstico molecular tendrá su mayor impacto cuando se detecte la presencia del patógeno en plantas y tubérculos asintomáticos, que serían la fuente primaria de inóculo.

El incremento de los lotes infectados con los síndromes descritos, va en dramático aumento en la región y en el país, debido a que la transmisión de la enfermedad a través de la semilla es cada vez mayor, al pasar inadvertida la mayoría de los tubérculos infectados. Las pérdidas producto de fallos en la regeneración de plántulas es de enorme impacto, por lo que las estrategias de manejo, control y, finalmente, de erradicación, deben basarse primordialmente en un diagnóstico preciso, eficaz y realizado en forma temprana sobre plantas o semillas asintomáticas.

El impacto de esta tecnología y sus alcances podrán aplicarse también en las medidas cuarentenarias y de certificación en el movimiento de semilla y material genético de papa a regiones libres del problema, así como en la introducción de germoplasma de otras partes del mundo.

El análisis de la secuencia de nucleótidos de los segmentos amplificados permitirá definir si se trata del mismo agente causal o de diversos organismos específicos de cada sintomatología ("punta morada", "bola de hilo", etc.). También, permitirá avanzar en estudios epidemiológicos al determinarse la identidad del o de los insectos vectores en la República Mexicana. Del trabajo aquí descrito se puede concluir que:

• Se implementó un método de diagnóstico del síndrome "bola de hilo" de la semilla de la papa, basado en la reacción en cadena de la polimerasa y enfocado plenamente hacia la facilitación y el apoyo de un estudio epidemiológico.

• La RCP permitió la detección de infecciones latentes o tempranas causadas por Phytoplasma spp. en semillas de papa asintomáticas que no pueden ser diagnosticadas eficientemente por ningún otro método utilizado previamente.

Agradecimientos

Los autores agradecen el apoyo brindado por los señores Manuel Villaverde-Benedet y Adolfo Romero-Padilla, y el apoyo técnico de Juan Carlos Ochoa Sánchez, Marlene Ríos-Bocanegra (CINVESTAV), Cesar Ignacio López Flores (Rancho La Providencia) Isidro Humberto Almeyda-León (INIFAP). Nuestra gratitud se extiende también a la Dirección General de Sanidad Vegetal, al CONACyT-SIHGO (Proyecto ALIM 18/97) y al Instituto de Investigación y Capacitación Agropecuaria, Acuícola y Forestal del Estado de México, por el apoyo financiero brindado.

Referencias

1. Martínez-Soriano JP, Ríos-Bocanegra M, Zavala-Soto ME, Robles-Murguía C, Almeyda-León IH. Detección de organismos tipo micoplasma. Congreso Nacional de Productores de Papa; Chihuahua, México; 1997.

2. Cadena-Hinojosa MA. Estudio sobre la "punta morada de la papa" [MSc]. Texcoco (México): Colegio de Postgraduados; 1974.

3. García-Quijano JR. Etiología y transmisión del obscurecimiento del tubérculo de la papa (Solanum tuberosum L.) para industria [MSc]. Montecillo, México: Colegio de Postgraduados; 1996.

4. Khurana PSM, Singh PA, Kaley DM. Mycoplasma-associated potato diseases and their control in India. In: Maramosch K, Raychaudhuri SP, editors. Mycoplasma disease of crops: basic and applied aspects. New York: Springer-Verlag; 1988. p.285-316.

5. Martínez-Soriano JP, Almeyda-León IH, Piña-Razo J, Rocha-Peña MA, Byerly-Murphy KF. Detection of Phytoplasma sp. associated with Lethal Yellowing of coconut palms using polymerase chain reaction. Rev Mex Fitopat 1994;12:75-80.

6. Lee I-M, Bertaccini A, Vibio M, Gundersen DE. Detection of multiple phytoplasmas in perennial fruit trees with decline symptoms in Italy. Phytopathology 1995; 85:728-35.

7. Chen KH, Credi R, Loi N, Maixner M, Chen TA. Identification and grouping of mycoplasma-like organisms associated with grapevine yellows and clover phyllody diseases based on immunological and molecular analyses. Appl Environ Microbiol 1994;60(6):1905-13.

8. Hiruki C. Fluorescence microscopy of yellows diseases associated with plant mycoplasma-like organisms. In: Maramosch K, Raychaudhuri SP, editors. Mycoplasma disease of crops: basic and applied aspects. New York: Springer-Verlag; 1988. p.51-76.

9. Lee IM, Davis RE, Hammond R, Kirkpatrick B. Cloned riboprobe for detection of a mycoplasma-like organism. Biochem Biophys Res Commun 1988;155(1):443-8.

10. Chen KH, Chen TA. A novel method for cloning DNA of plant-pathogenic mycoplasma-like organisms. Can J Microbiol 1995;41(8):753-7.

11. Gundersen DE, Lee IM, Schaff DA, et al. Genomic diversity and differentiation among phytoplasma strains in 16S rRNA groups I (aster yellows and related phytoplasmas) and III (X- disease and related phytoplasmas). Int J Syst Bacteriol 1996; 46(1):64-75.

12. Lee I-M, Hammond RW, Davis RE, Gundersen DE. Universal amplification and analysis of pathogen 16S rDNA for classification and identification of mycoplasma-like organisms. Phytopathology 1993;83: 834-42.

13. Rogers SO, Bendich AJ. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues. Plant Mol Biol 1985;5:69-76.

14. Doyle JJ, Doyle JL. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 1990;12:13-5.

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16. Almeyda-León IH. Detección molecular de fitoplasmas y su uso en el diagnóstico del amarillamiento letal del cocotero [PhD]. Monterrey (México): Universidad Autónoma de Nuevo León; 1997.

17. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning. A laboratory manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989.

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