Biotecnologia Aplicada Elfos Scientiae ISSN: 0684-4551 Vol. 16, Num. 2, 1999

Carmen E Gómez, Javier J Menéndez, @ Bianca M García

División de Biotecnología Industrial, Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología. AP 6162,
CP 10600, Ciudad de La Habana, Cuba. Teléfonos: (53-7) 21 6022, 21 8164,
Fax: (53-7) 21 8070. E-mail: dextranasa@cigb.edu.cu

In this study, the expression and secretion of dextranase enzyme from the fungus Penicillium minioluteum in the non-conventional yeast Kluyveromyces lactis, was evaluated. The cDNA encoding this protein with its own signal peptide was integrated into the genome of K. lactis strain MW105-2A under the control of the LAC4 promoter. Dextranase was detected by the hydrolysis of blue dextran added to solid growth medium and the enzymatic activity was determined colorimetrically by the DNSA method. Dextranase was efficiently expressed and secreted in this yeast. The obtention of this construction constitutes the first step in the use of dextranase-encoding gene as reporter in gene expression studies in the yeast K. lactis.

Keywords: dextranase, gene expression, Kluyveromyces lactis, Penicillium minioluteum

Introducción

Uno de los métodos más empleados para el estudio de la expresión génica en levaduras, es la fusión de la región promotora de interés a un gen reportero, el cual debe codificar una proteína que sea detectada fácilmente. Entre los genes reporteros utilizados más frecuentemente en estos microorganismos, se encuentra el gen lacZ de Escherichia coli, que codifica la enzima b-galactosidasa [1, 2]. Esta enzima tiene varias ventajas que la hacen atractiva como reportera en el estudio de la expresión génica: primero, el gen y su producto están bien caracterizados, tanto genética como bioquímicamente [2]; segundo, existen ensayos que emplean sustratos disponibles comercialmente, incluyendo algunos que permiten la visualización de la actividad enzimática in situ.

No obstante, esta enzima no es ideal en todos los sistemas. Por ejemplo, en el caso de la levadura Kluyveromyces lactis, los niveles endógenos de actividad b-galactosidasa son lo suficientemente altos como para impedir la detección de la b-galactosidasa quimérica por métodos enzimáticos.

Otro de los genes que se han empleado como reporteros para el estudio de la expresión génica, es el que codifica la enzima cloranfenicol-acetil-transferasa (CAT). En la mayoría de los eucariotas existe una actividad CAT endógena muy baja, pero los ensayos enzimáticos suelen ser muy caros [3].

La enzima dextranasa (EC 3.2.1.11, a-1,6-glucano a-D-6-glucanohidrolasa) hidroliza los enlaces glicosídicos a(1®6) dentro de la molécula de dextrana. El ADNc codificante de esta enzima de 67 kDa fue aislado por García y colaboradores [4]. Por otra parte, Roca y colaboradores [5] reportaron el aislamiento y la secuenciación de este gen, al que denominaron dex. La secuenciación del clon genómico mostró que, a diferencia de lo que ocurre en otros genes aislados de hongos, el gen dex no contiene intrones. Además, este gen se expresó eficientemente en la levadura metilotrófica Pichia pastoris [5]. Este resultado sugirió el posible empleo del gen codificante de esta enzima como reportero en el estudio de la expresión génica en levaduras.

Otra de las ventajas que presenta el empleo del gen dex, es que los sustratos de la enzima dextranasa son solubles en agua y están disponibles comercialmente. También, al secretarse esta enzima en el medio de cultivo, es posible realizar el ensayo de actividad en placas de medio sólido mediante el empleo de un sustrato cromogénico, la dextrana azul. La actividad enzimática se evidencia por la formación de halos de hidrólisis.

La levadura no convencional Kluyveromyces lactis es ampliamente utilizada en la expresión de proteínas heterólogas por su capacidad secretora y su crecimiento fácil en sustratos baratos como el suero de leche [6, 7].

En el presente trabajo se reporta la expresión y secreción eficiente al medio de cultivo de la dextranasa proveniente del hongo Penicillium minioluteum como primer paso en la construcción de vectores que permitan el estudio de la expresión génica en esta levadura mediante el empleo del gen dex como reportero.

Materiales y Métodos

Cepas, plásmidos y medios de cultivo

Las cepas de bacterias y levaduras, así como los plásmidos empleados en este estudio, se muestran en la Tabla 1. Las cepas de bacterias utilizadas en la propagación de las construcciones genéticas, se crecieron en medio LB (triptona 1%, extracto de levadura 0,5%, NaCl 0,2 M) suplementado con ampicillina (50 mg/mL). Las cepas de levaduras se crecieron en medio rico YP (extracto de levadura 1% y peptona bacteriológica 2%) suplementado con glucosa 2% (YPD) o lactosa 1% (YPL). En la selección y manipulación de los transformantes, se empleó el medio mínimo YNB (Yeast Nitrogen Base) suplementado con glucosa 2%. Para la preparación de los medios sólidos, se adicionó agar técnico a los medios líquidos.

Tabla 1. Cepas y plásmidos empleados en este trabajo.

Métodos de ADN recombinante

Todas las técnicas rutinarias de manipulación del ADN se realizaron según Sambrook y colaboradores [11]. El marcaje de ADN para los experimentos de hibridación, se realizó de acuerdo a las especificaciones del juego de reactivos de Boehringer Mannheim, que se basa en los resultados de Feinberg y Volgelstein [12], y utilizando [a32P]dATP (> 3000 Ci/mmol, Amersham, Reino Unido) como nucleótido radiactivo. Las sondas empleadas fueron el ADNc que codifica la dextranasa, extraído del plásmido pBDEX mediante digestión con las enzimas de restricción EcoRI y XhoI, o un fragmento de 300 pb del gen de la lactasa de K. lactis, extraído del plásmido pK16 mediante digestión con la enzima de restricción HindIII. Para los experimentos de Southern blot, el ADN total se separó electroforéticamente en geles de agarosa a 0,6% y se transfirió a membranas de Hybond-N (Amersham, Reino Unido), y las hibridaciones se realizaron durante toda la noche a 42 °C en una solución que contiene SSC 6X, Denhardt's 5X, SDS 0,5%, formamida 50% y ADN de esperma de salmón 200 mg/mL, previamente desnaturalizado a 95 °C. Después de la hibridación, los membranas se lavaron dos veces a temperatura ambiente en una solución de SSC 2X, SDS 0,1%, y una vez en una solución de SSC 0,2X y SDS 0,1% a 65 °C. El ADN genómico de levadura se purificó de acuerdo con el protocolo descrito por Rothstein [10].

Construcción del vector de expresión en K. lactis pGKC1-DEX

El fragmento de ADN codificante de la dextranasa se amplificó mediante la reacción en cadena de la polimerasa (RCP) utilizándose el plásmido pBDEX como molde, la enzima Taq ADN polimerasa y los oligonucleótidos D2 (5'-CATGCTAAAGCTAC TTGCGTTGA-3') y D5 (5'-GGAAACCTG
GAAATGTCCTTAT-3'). La reacción de PCR se llevó a cabo durante 30 ciclos de desnaturalización (30 s a 94 °C), hibridación (30 s a 60 °C) y extensión (2 min a 72 °C). El producto de la RCP se fosforiló en los extremos empleando la enzima T4 PNK (Boehringer Mannheim, Alemania) y se ligó al vector pGKC1 [13], para dar lugar al plásmido pGKC1-DEX. Previo a la ligación con el gen dex, el plásmido pGKC1 se digirió con la enzima HindIII, seguido de tratamiento con la nucleasa Mung bean durante 1 h a 25 °C y por último, se desfosforilaron los extremos con fosfatasa alcalina (Boehringer Mannheim, Alemania).

Transformación de K. lactis y selección de los clones productores de dextranasa

Para la transformación de la levadura K. lactis, se emplearon alrededor de 5 mg del plásmido pGKC1-DEX, digerido previamente con la enzima PvuII. La transformación se llevó a cabo mediante electroporación [14] en cubetas de 0,2 cm. Las condiciones de electroporación fueron las siguientes: 4,5 kV/cm, 25 mF y 400 W durante 11 ms. Inmediatamente después de la aplicación del pulso eléctrico, se adicionó 1 mL de sorbitol 1M frío a la suspensión celular y los transformantes URA3+ se seleccionaron en placas de medio mínimo YNB [15] con glucosa 2%. De los transformantes obtenidos, se transfirieron 21 a placas de medio mínimo suplementado con glucosa 2% o lactosa 1%, y en ambos casos se adicionó dextrana azul 0,4%. Las placas se incubaron durante toda la noche a 28 °C hasta que aparecieron halos de hidrólisis de la dextrana alrededor de las colonias.

Finalmente, se seleccionaron tres de los transformantes para realizar estudios de expresión. Estos clones se inocularon en 5 mL de medio YPD líquido y se crecieron a 28 °C durante toda la noche. A partir de estos precultivos, se inocularon independientemente 200 mL de medio YPD, los que a su vez sirvieron de inóculo para un fermentador Biolafitte de 4,5 L de volumen efectivo. La fermentación se mantuvo durante 90 h a 30 °C, 1,5 v/v/m de areación, 600 rpm de agitación y pH 5,4. Cada 24 h se adicionó lactosa 1% como inductor.

Preparación de los extractos celulares y determinación de la actividad dextranasa

Las células se colectaron por centrifugación del cultivo fermentado y el sobrenadante se utilizó para la determinación de la actividad de la enzima secretada al medio de cultivo. Del sedimento se pesaron 400 mg, se lavaron dos veces con agua destilada, se resuspendieron en 400 mL de tampón de ruptura (NH4Ac 20 mM pH 5, EDTA 5 mM y PMSF 2 mM) y se adicionaron 400 mg de perlas de vidrio (0,3 mm) esterilizadas. La ruptura se realizó mediante agitación rigorosa en vórtex cuatro veces durante 1 min, con reposo de 1 min en hielo entre golpes. Posteriormente, se centrifugó a 500 rpm (Himac Centrifuge, Hitachi®, Japón) para separar las perlas de vidrio, el sobrenadante se pasó a otro tubo y las perlas se lavaron con 50 mL adicionales de tampón de ruptura. Por último, se centrifugó a 15 000 rpm (Himac Centrifuge, Hitachi®, Japón) durante 10 min para separar el sobrenadante de ruptura del sedimento. Para las determinaciones de la actividad enzimática, se pesaron 100 mg del sedimento de ruptura, se lavaron dos veces con agua destilada y se resuspendieron en 1 mL de agua destilada.

La actividad dextranasa se determinó según Kosaric y colaboradores [16]. Una unidad de actividad se definió como la cantidad de azúcar reductor, expresada en micromoles, liberada en 1 min a pH 5 y 40 °C . Los azúcares reductores se determinaron por la reacción con el ácido dinitrosalicílico (DNSA) [17], de la siguiente manera: a 100 mL de muestra se le añadieron 400 mL de tampón acetato de sodio 50 mM pH 5,2 y 500 mL de dextrana T-2000 2,5% (Pharmacia, Estados Unidos). Se incubó 10 min a 40 °C y se inactivó la enzima mediante calentamiento durante 5 min a 100 °C. Luego, se añadió 1 mL de DNSA y se incubó 10 min a 100 °C para desarrollar el color. Finalmente, se determinó la absorbancia a 546 nm contra un blanco formado por sustitución de la muestra por 100 mL de tampón acetato. Paralelamente, se prepararon controles para determinar la cantidad de azúcares reductores presentes inicialmente en las muestras; en este caso, se adiciona la dextrana después de inactivada la enzima y se continúa el procedimiento igual que para las determinaciones de actividad enzimática.

Western blot

El método de Western blot se realizó de acuerdo con el protocolo descrito por Towbin y colaboradores [18]. La electroforesis en geles de poliacrilamida (12,5%) se llevó a cabo de acuerdo a las especificaciones del manual de protocolos de Promega (Estados Unidos) [19]. Una vez realizada la electroforesis, las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa Hybond-C (Amersham, Reino Unido), utilizando el sistema Mighty Small Transunit (Hoefer Scientific Instrument, CA, Estados Unidos) a una corriente constante de 300 mA por 2 h. Para la preparación de las muestras, se tomó 1 mL del sobrenadante de cultivo, se centrifugó a 14 000 rpm durante 10 min y se desechó el sedimento. Al sobrenadante se le adicionaron 16 mL de desoxicolato de sodio 2% preparado al momento, se agitó y se incubó en hielo durante 15 min. Transcurrido este tiempo, se adicionaron 500 mL de ácido tricloroacético (TCA) 20% y se agitó por inversión. Posteriormente, se centrifugó a 15 000 rpm durante 30 min a 4 °C y se desechó el sobrenadante. El precipitado se lavó con 660 mL de TCA 8% (v/v) y luego con acetona, se secó y se resuspendió en 10 mL de EDTA 50 mM pH 8. En la electroforesis se aplicó todo el volumen, el cual corresponde a 1 mL del sobrenadante del cultivo inicial.

Las muestras del sobrenadante y del sedimento de ruptura, se prepararon como se describió anteriormente, pero a partir del sedimento de la centrifugación del cultivo original. Para la electroforesis en gel de poliacrilamida (12,5%) se tomaron 15 mL, equivalentes a 0,3 mL del volumen del cultivo inicial.

Resultados y Discusión

Transformación de K. lactis con el vector pGKC1-DEX y selección de los transformantes

Con el objetivo de fusionar el ADNc codificante de la dextranasa al promotor y al terminador del gen LAC4 de K. lactis, se construyó el plásmido pGKC1-DEX. En esta construcción se empleó como señal de secreción la del propio gen que codifica la dextranasa (Figura 1).

Figura 1. Esquema del plásmido pGKC1-DEX en el que el gen dex de P. minioluteum se fusionó al promotor LAC4 de K. lactis. El plásmido se digirió con la enzima Pvu II, previo a la transformación.

La frecuencia de transformación de la levadura se ve estimulada cuando los plásmidos integrativos utilizados se linealizan con una enzima de restricción que permita dirigir la integración al locus cromosomal de interés, lo que favorece el evento de recombinación [20]. Van der Berg y colaboradores [6] reportaron la expresión de la proquimiosina bovina mediante el empleo de plásmidos integrativos linealizados con la enzima SacII, que corta en un sitio único presente en el promotor. En el caso que se reporta, no se pudo aplicar este mismo esquema de integración por la carencia de un sitio único en la región promotora del gen dex en el plásmido pGKC1-DEX. Por tal motivo, se digirió con la enzima PvuII que corta a ambos lados del fragmento de expresión, de forma tal que esta construcción genética integra en el genoma de K. lactis de acuerdo con el modelo de reemplazamiento génico de Rothstein [21]. Este modelo predice una gran estabilidad del ADN integrado y la pérdida de la información en el locus de integración.

Una vez realizada la digestión del plásmido pGKC1-DEX, la banda de 5,3 kpb que contiene el fragmento de expresión se empleó para transformar la cepa MW 105-2A, y se seleccionaron los transformantes por su capacidad de crecer en placas de medio mínimo carente de uracilo. De los transformantes obtenidos, se aplicaron 21 sobre placas que contenían medio selectivo suplementado con glucosa o lactosa como fuente de carbono, y dextrana azul como sustrato de la enzima para la identificación de los transformantes con actividad dextranasa.

Las placas se incubaron a 28 ºC y al cabo de las 6 h se observaron zonas de aclaramiento alrededor de algunas colonias producto de la hidrólisis del sustrato por la dextranasa (Figura 2). Como la dextrana azul es un polímero de elevado peso molecular (2 x106 g/mol) que no puede entrar a la célula, el hecho de encontrar actividad enzimática implica que la proteína se está secretando al medio de cultivo o que se libera producto de autólisis celular. Como control negativo del experimento, se emplearon transformantes de la cepa MW 105-2A que contienen el plásmido pGKC1. En ninguno de ellos se observó actividad dextranasa. Curiosamente, la actividad que se encontró en algunos transformantes pudo ser detectada, tanto en placas que presentan el inductor, como en las que contienen glucosa, aunque la actividad fue mayor en las primeras. Este resultado evidenció que en la cepa empleada no se manifiesta la represión por glucosa sobre el gen LAC4 al mismo nivel que en otras cepas hospederas de K. lactis [6]. Callejo reportó un resultado similar en la expresión de la proquimiosina bovina utilizando la cepa CBS 683 del mismo hospedero [22].

Figura 2. Análisis de los transformantes que contienen el plásmido pGKC1-DEX en placas de medio mínimo YNB, empleando lactosa (A) o glucosa (B) como fuente de carbono. En ambos casos, se adicionó dextrana azul 0,4% a cada placa, lo que permitió visualizar la actividad enzimática a través de la formación de halos de hidrólisis alrededor de las colonias que expresan y secretan correctamente la enzima. En la parte inferior de la placa, aparecen cuatro colonias que se emplearon como control negativo, y que se corresponden con una construcción integrativa que porta el gen de la insulina.

Análisis del evento de integración

Con el objetivo de determinar el tipo de integración en el genoma de K. lactis que presentan los transformantes estudiados, se realizó un análisis de nueve de ellos mediante Southern blot. La Figura 3 muestra los tipos de integración que pueden producirse al introducir el ADN plasmídico en la célula hospedera. La Tabla 2 resume las tallas de las bandas que deben obtenerse en cada caso con el empleo del gen de la dextranasa o de la lactasa como sondas.

Figura 3. Esquema del vector de expresión pGK de K. lactis y eventos de integración más probables que pueden ocurrir en el locus LAC4. (A) Integración por doble recombinación. (B) Integración por simple recombinación en el promotor. (C) Integración por simple recombinación en el terminador. La banda reforzada que se señala en el locus cromosomal LAC4, representa el fragmento HindIII de 300 pb empleado como sonda radiactiva en los experimentos de Southern blot.

Tabla 2. Tallas obtenidas al hibridar el ADN cromosomal de los transformantes de K. lactis con las sondas de la dextranasa y la lactasa.

-No se detecta señal

Para analizar el patrón de integración presente en cada uno de los transformantes, el ADN total extraído de cada uno de ellos se digirió con la enzima de restricción KpnI . Todos los transformantes analizados muestran una banda de 4,3 kpb al hibridar con el gen dex (Figura 4A). En la carrilera 2, aparece la banda utilizada como control positivo de hibridación, correspondiente al plásmido pGKC1-DEX digerido con la enzima PvuII. En la carrilera 11, se aprecia el ADN total de la cepa hospedera utilizado como control negativo, sin que se detecte señal alguna. En este caso se observa una sola banda, pues el sitio KpnI presente en el gen dex se encuentra muy próximo al extremo 5' (Figura 4). Con este experimento se evidenció que el gen dex se integró en el genoma de la levadura, pero no puede determinarse el tipo de integración que ocurrió.

Figura 4. Análisis por Southern blot de los transformantes que portan el plásmido pGKC1-DEX. En el panel A se empleó como sonda el ADNc codificante de la enzima dextranasa, y en el panel B el fragmento HindIII de 300 pb del gen de la lactasa de K. lactis extraído del plásmido pK16. En las carrileras 3-10 aparecen los ADN de los diferentes transformantes digeridos con la enzima KpnI (10 mg); en las carrileras 2 y 11 aparecen el plásmido pGKC1-DEX/PvuII (30 ng) y el ADN de la cepa hospedero (10 mg), empleados como control positivo y negativo, respectivamente. Las tallas del ADN empleado como patrón de peso molecular (l/HindIII) se muestran a la izquierda de esta Figura. Las flechas indican la posición de la banda de interés.

Para discriminar entre un evento de simple y uno de doble recombinación, los filtros con el ADN fijado se hirvieron en una solución de SDS 0,1% y se dejaron a temperatura ambiente hasta que descendió a 50 ºC. Posteriormente, se utilizaron para hibridar con una sonda de 300 pb correspondiente a la región central del gen codificante de la lactasa. Esta sonda se obtuvo mediante digestión del plásmido pK16 con la enzima de restricción HindIII, la cual no incluye ni al promotor ni al terminador del gen presentes en el plásmido pGKC1-DEX. Como se observa en la Figura 4B, en todas las líneas aparece una banda de 4,4 kpb que no difiere en intensidad cuando se compara con el ADN de la cepa salvaje (carrilera 11), lo que descarta la posibilidad de que el fragmento de expresión se haya integrado por doble recombinación con la consiguiente pérdida del locus LAC4. Con este resultado, también se descarta un evento de simple recombinación por la región promotora, lo que deja solamente la posibilidad de que el fragmento de interés se haya integrado mediante simple recombinación por el terminador, o por un evento de recombinación no homóloga.

Finalmente, se pueden concluir que el locus LAC4 permanece intacto, lo que se corroboró, además, en experimentos de cultivo en zaranda realizados con varios de estos transformantes, mediante el empleo de lactosa 1% como fuente de carbono. En todos los casos se obtuvo un crecimiento similar al de la cepa salvaje (resultado no mostrado).

En Saccharomyces cerevisiae, el reemplazamiento de la información del locus de integración es una regla general. Bastan solamente 0,2 kpb de homología para obtener 100% de recombinación homóloga [23]. De manera diferente, en hongos, la mayoría de los eventos de integración ocurren por recombinación no homóloga [23]. En un estudio realizado en Neurospora crassa, sólo 1 de 89 transformantes resultó de un evento de recombinación homóloga que involucró de un fragmento de integración con una homología de 5 kpb en cada extremo con relación al genoma del hospedero. Sin embargo, al emplearse una de región de homología de 9 kpb, se logró aumentar en 30% la probabilidad de que ocurra una recombinación homóloga [24].

Los resultados obtenidos con la cepa hospedera empleada en este trabajo, muestran que ésta se comporta de manera similar a los hongos. Un resultado similar fue obtenido por Ferbeyre para la expresión de proquimiosina bovina en la cepa VD1 de K. lactis [25].

Expresión del gen dex en K. lactis

La expresión del gen dex a nivel de la traducción se monitoreó en la levadura, tanto por inmunodetección, como por actividad enzimática. Como se observa en la Tabla 3, en la cepa transformada con el plásmido pGKC1 no se evidenció actividad dextranasa en ninguna de las condiciones probadas. Sin embargo, en los transformantes que portan el gen dex se detectó actividad dextranasa en el sobrenadante de cultivo. La expresión de la enzima no afectó los parámetros de crecimiento de la cepa transformada (MWDEX), ya que el tiempo de generación en medio YPD fue muy similar al que se obtuvo para la cepa que no porta el gen (resultado no mostrado).

Tabla 3. Determinación de la actividad dextranasa en la levadura K. lactis.