De todos los órganos de las plantas, la hoja es el mas flexible en responder a las condiciones del medio ambiente, en éstas se refleja más claramente que en el tallo o la raíz los efectos de estreses por condiciones ambientales o heterogeneidad (Levit, 1980). La asimilación y respiración, ritmos dirigidos por hormonas y movimientos inducidos por el medio ambiente parten de la hoja y solamente pueden ser realizados cuando el clima, el suelo y la vida circundante no entorpecen estas funciones (Vareschi, 1992).

Entre las estructuras que conforman  el tejido epidérmico, se ubican los estomas  formados por  un ostíolo rodeado por dos células oclusivas de forma arriñonada, las cuales pueden estar acompañadas o no por otras células epidérmicas estructural y fisiológicamente asociadas a los estomas, que reciben el nombre de subsidiarias (Ruiz et al.,1962; Lindorff et al., 1991, Flores-Vindas, 1999).

La posición de los estomas sobre la superficie de la lámina es variable en sección transversal;  se pueden presentar hundidos, al mismo nivel de las otras células epidérmicas o proyectarse hacia el exterior de la lámina (Flores-Vindas, 1999). Otra característica es la  distribución en  la superficie de la lámina foliar, en las hojas en las cuales estas estructuras se ubican en la epidermis superior de la lámina se conocen como  epiestomáticas;  si están en la inferior, son hipostomáticas y por último, si se presentan en ambas superficies, adaxial y abaxial, son anfiestomáticas  (Flores-Vindas, 1999). 

Sánchez-Díaz y Aguirreolea (1996) consideraron que los estomas tienden a ser mas frecuentes en la superficie abaxial de las hojas y en algunas especies, sólo se presentan en esta. A juicio de estos mismos autores, estas estructuras  desempeñan un papel vital en el mantenimiento de la homeostasis de la planta  y de ahí la importancia de conocer tanto el número como la forma en que los poros se abren y se cierran como también los factores que controlan estos procesos. Las láminas foliares de las hojas de la lima Tahití (C. latifoliaTanaka) son hipoestomáticas  y la formación de los estomas parece cesar cuando  este órgano alcanza aproximadamente una cuarta parte del tamaño definitivo (Chaudler, 1962).

Roth et al. (1986) plantearon que  en  los estudios relacionados con la anatomía foliar, se deben considerar fenómenos anatómicos individuales tales como  los  índices estomáticos (IE), y  que este valor puede variar dentro de la misma hoja según la parte del limbo que se utilice (ápice, media o base), en el mismo individuo cuando se consideran las hojas en diferente posición en la planta, además el ambiente ecológico puede ejercer cierta  influencia sobre este carácter.  Del mismo modo, la densidad estomáticas (DE) alta o baja parece estar relacionada con ciertas familias, también  existe una  relación  conspicua entre la DE y  el tamaño de las células oclusivas, así altas densidades se presentan en plantas con células oclusivas pequeñas. Sanabria (2003) encontró que las hojas de Heliconia latispathaBentham (Heliconiaceae) presentan mayores valores de DE y los IE más altos.

La frecuencia estomática es el número de estomas por unidad de área de superficie foliar (Esau, 1972) y según Wilkinson, (1979) representa un valor diagnóstico para fragmentos de láminas foliares. Este mismo autor señala que el IE sirve para expresar el número de estomas por superficie foliar, independientemente del tamaño de las células epidérmicas. Tanto la DE como el IE pueden estar influenciados por las condiciones ambientales y nutricionales (Esau, 1972; Wilkinson, 1979; Roth et al., 1986). Verdugo et al. (1999) afirmó que las hojas con mayores valores de IE  presentan los mayores valores de  DE.

La transpiración y la intensidad de la respiración está en razón directa al número y abertura de los estomas y como las hojas son los principales órganos de las plantas donde se realiza la fotosíntesis, la cantidad y distribución de los estomas influyen directamente sobre la asimilación clorofílica (Ruiz et al., 1962). Rubino et al. (1989) y Thakur (1990) señalan que la disminución de la cantidad de estomas por mm² incrementa la resistencia estomática de la planta y de esta manera evita un exceso de transpiración; sin embargo, tanto la DE como el IE son tan  variables que están fuertemente influenciadas por diversas condiciones estresantes como condiciones de sequía y altas concentraciones salinas además el material vegetal que se trate (Salas et al., 2001; Bethke y Drew, 1992; Rubino et al., 1989).

A juicio de Lindorff et al. (1991) consideran el número de estomas por unidad de superficie es muy variable; sin embargo Verdugo et al. (1999) consideran que poco se sabe acerca de la regulación de los programas de desarrollo que generan los patrones de densidad y distribución estomática en  respuesta a variables ambientales, encontrando diferencias entre los promedios de densidad estomática de variedades de ajo (Alliumsp.), las cuales no fueron significativas entre la tercera y cuarta hoja, ni entre las superficies adaxiales y abaxiales, y según los resultados de estos mismos autores, las hojas con mayores valores de densidad estomática, también presentaron los mayores valores de índice estomático. Schoch et al. (1980) confirmaron que el índice estomático es una función total de la radiación recibida y de las variaciones que experimenta durante los días precedentes a la diferenciación de los estomas de la hoja. 

Esau (1972) establece un rango de 100 a 300 estomas/mm² en las angiospermas; Napp (1974) estima para hojas de diferentes especies valores de 1 a 2.000 estomas/mm² y Leegod (1993) determinó para el envés de las hojas de plantas C3, de 40 a 300 estomas/mm². A juicio de Lindorff et al. (1986) y Mérida (1986) no solamente las condiciones ambientales influyen sobre los valores de densidad estomática, también la alta o baja densidad está relacionada en cierto modo con las familias de plantas. Pares et al. (2003) al estudiar la densidad e índice estomático en hojas de Annonamuricata, A.montana, A. muricata/A. muricata y A. muricata/A. montana, concluyeron que la técnica de injertación afectó los valores de DE disminuyendo el número de estomas/mm², lo que se puede interpretar como un aspecto positivo ya que se aumenta la resistencia estomática, incrementando la adaptabilidad de las plantas a condiciones estresantes  en el suelo. En este caso, los mayores valores de DE coincidieron con los mayores valores de IE.

Los objetivos del presente estudio fueron  caracterizar los estomas de las láminas foliares de lima Tahití(C. latifoliaTanaka),  determinar el índice estomático  y número de estomas /mm² de los  tercios apicales,  medios y básales  y  su variación en función a la injertación sobre ocho patrones cítricos.

MATERIALES Y MÉTODOS

El material vegetal evaluado consistió en hojas completamente desarrolladas de lima Tahití (C. latifoliaTanaka) injertada sobre ocho patrones cítricos: limón Volcameriano, limón Cravo, mandarina Cleopatra, Citrange carrizo, CitrangeUvalde, CitrusmeloSwingle, CitrangeTroyer y CitrangeYuma; colectadas en el Campo Experimental Santa Bárbara, Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas (INIA) , ubicado a 195 m.s.n.m.

Se colectaron cuatro (4) hojas del tercio medio de la copa, las ubicadas en el nudo número ocho en sentido basípeto de las ramas con crecimiento secundario, considerando al eje principal como el punto de partida, de orden cero. De cada hoja se fijaron en F:A:A 70% (Cutler, 1978) los tres tercios. De esta muestra se tomaron segmentos que se sometieron a una solución con hipoclorito de sodio al 40% y se calentaron hasta que se separaron las epidermis adaxiales y abaxiales, otros se seccionaron transversalmente para ser usados en la determinación de la ubicación de los estomas con respecto a las restantes células epidérmicas. Las muestras procesadas se tiñeron con eosina y se hicieron los montajes semipermanentes con agua- glicerina (1:1) (Salas et al., 2001).

Se realizaron un total de 20 observaciones correspondientes a las cuatro repeticiones por cada tratamiento. La caracterización de los estomas y la determinación del índice estomático (IE) y la densidad estomática (DE) se realizaron con un microscopio óptico OLYMPUSBX40 en un cuerpo de 400X. El I.E se calculó utilizando la formula sugerida por Wilkinson (1979):

La DE se obtuvo determinando el número de estomas observados en un área de 4,347 mm², equivalente al diámetro del campo observado.

El diseño estadístico empleado fue un completamente aleatorio, con ocho tratamientos y cuatro repeticiones. Las variables cuantitativas determinadas se procesaron estadísticamente mediante el análisis de varianza y los valores medios de los tratamientos fueron comparados mediante el método de la mínima diferencia significativa. Para el análisis se utilizó el programa estadístico Statistix (versión 2, Analytical software).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los estomas de la lámina foliar de las hojas de lima Tahití resultaron ser del tipo anisocíticos. Estos resultados  coinciden con Sánchez-Díaz y Aguirreoles (1996) en el sentido de que estas estructuras tienden a ser mas frecuentes en la superficie abaxial de las hojas; y contrario a lo establecido por Chaudler (1962), la lámina foliar fue anfistomática  (Flores-Vindas, 1999). 

El cuadro 1 muestra los valores de IE y DE  en la lámina foliar de lima Tahití  injertada sobre ocho patrones cítricos. Se encontró un efecto producido por el patrón sobre estas variables, siendo los valores de IE en la superficie adaxial en los patrones Citrange Carrizo y CitrangeUvalde estadísticamente superiores (p ≤ 0,01) al resto de los patrones; sin embargo en la superficie abaxial de la hoja el comportamiento es diferente, siendo los patrones mandarina Cleopatra y CitrusmeloSwingle, estadísticamente superiores al resto.

Tal cual lo establecido por Schoch et al. (1980); Roth et al. (1986); Lindorff et al. (1991), se observaron diferencias entre los valores de DE para ambas superficies; en la  adaxial  las hojas de los patrones mandarina Cleopatra y CitrusmeloSwingle presentaron los valores más altos de DE y en la  abaxial el mayor valor lo presentaron los patrones Citrange Carrizo y CitrangeUvalde. Los resultados obtenidos demuestran que existe variación en el IE y DE en la superficie de la lámina de la hoja de lima con respecto al patrón o portainjerto utilizado. Estos resultados se corresponden con lo observado por Pares et al. (2003) en plantas de Guanábana,  donde la técnica de injertación afectó los valores de DE, lo que se podría interpretarse como un aspecto positivo, debido a que aumenta la resistencia estomática, incrementándose la adaptabilidad de las plantas a las condiciones edafoclimáticas de las zonas. Napp (1974) considera que los valores de IE y DE son diferentes en las especies, cabe destacar que aunque la copa es lima Tahití, los patrones son diferentes especies pertenecientes al género Citrus.

El Cuadro 2 muestra los valores promedios  de IE y DE  en las superficies adaxial y abaxial de la lámina de lima Tahití, en los tercios apical, medio y basal. Se encontró que en la superficie adaxial los valores de IE y DE en el tercio basal resultaron estadísticamente superiores (p< 0,01) al resto de los tercios. Tanto el IE y la DE son iguales en su valor numérico en los tercios estudiados, sin embargo en la superficie abaxial el IE y la DE de los tercios apical y medio resultaron estadísticamente iguales y diferentes al tercio basal, estos resultados confirman lo establecido por Roth (1986) y esta variación puede deberse a las condiciones agroecológicas de sabanas del Municipio Santa Bárbara, Estado Monagas, donde los suelos son arenosos, retienen poca humedad, son bajos en fertilidad y las condiciones climáticas varían durante el año, presentándose periodos largos de sequía (Cuadro 3).

Cuadro 3. Características climáticas del Municipio Santa Bárbara.
	Evaporación (mm)	Precipitación (mm)	Temperatura media (ºC)	Temperatura mínima (ºC)	Temperatura Máxima (ºC)	Humedad relativa (%)	Insolación
Promedio anual	1916,08	993,85	26,59	21,56	31,61	71,6	237,4

La fuerte reducción del IE y DE en la superficie adaxial de la lámina foliar de la lima fue compensada por un incremento de estos valores para la abaxial, lo que indica una respuesta de la planta a las condiciones edafoclimáticas adversas. A juicio de Martin et al. (1994) estos cambios en la anatomía de la hoja están relacionados con el estrés hídrico.

CONCLUSIONES