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Revista Científica UDO Agrícola
Universidad de Oriente Press
ISSN: 1317-9152
Vol. 9, Num. 3, 2009, pp. 475-486
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Revista Científica UDO Agrícola, Vol. 9, No. 3, July -September,
2009, pp. 475-486
Ingeniería genética aplicada al café
Genetic engineering applied to coffee
Zoraya DE GUGLIELMO CRÓQUER
Laboratorio de Genética, Instituto de Oncología y Hematología,
Universidad Central de Venezuela. Ciudad Universitaria, Los Chaguaramos,
Caracas, Venezuela. E-mail: zdegugli@gmail.com
Recibido: 17/03/2009 Fin de primer arbitraje: 03/08/2009
Primera revisión recibida: 09/08/2009 Aceptado: 01/10/2009
Code Number: cs09060
RESUMEN
Café es el nombre común de las semillas provenientes de
los arbustos del género Coffea, de la familia de las Rubiáceas,
cuyo cultivo tiene gran importancia agronómica y comercial en
el mundo. Esta planta está expuesta a distintos tipos de estrés
biótico y abiótico que pueden afectar su rendimiento y
productividad, ocasionando pérdidas económicas considerables.
Debido a esto, se han realizado diversas investigaciones enfocadas en
su mejoramiento tanto por métodos tradicionales como por ingeniería
genética. En este trabajo se realizó una revisión
sobre aspectos básicos de la aplicación de técnicas
de biología molecular y cultivo de tejidos para el desarrollo
de resistencia a factores biológicos y físicos que afectan
al café.
Palabras clave: Café, ingeniería genética, transformación
genética, cultivo in vitro
ABSTRACT
Coffee is the common name of seeds from bushes of the genus Coffea,
family Rubiaceae, whose cultivation is of great agricultural and commercial
importance on the world. This plant is exposed to various biotic and
abiotic stress that can affect its performance and productivity, causing
considerable economic losses. Because of this, there have been several
investigations focused on its improving both by traditional methods such
as genetic engineering. In this paper, a review was conducted on basic
aspects of the application of molecular biology techniques and tissue
culture for the development of resistance to biological and physical
factors affecting the coffee.
Key words: Coffee, genetic engineering, genetic transformation, in vitro
culture
INTRODUCCIÓN
Desde que el hombre comenzó a sembrar semillas silvestres y a
escoger las plantas y frutos por su color, sabor, textura y conservación
se produjo un proceso de selección que condujo a la modificación
de las frecuencias alélicas en un cultivo. Posteriormente, se
introdujo el mejoramiento formal con las hibridaciones entre individuos
seleccionados, lo que permitió la transferencia de caracteres
de interés entre especies e, incluso, de especies silvestres a
las de interés agronómico. En los últimos años,
con el auge de las técnicas moleculares y los sistemas de cultivo
in vitro ha surgido la Ingeniería Genética de Plantas,
la cual ha revolucionado las técnicas de mejoramiento convencionales,
ya que con esta disciplina que tiene los mismos objetivos del fitomejoramiento
clásico, se incrementa el rango de caracteres de interés
a transferir a las especies vegetales: estos caracteres no sólo
están codificados por genes de origen vegetal, sino también
animal o microbiano (Sánchez 2003). Todo esto para obtener mejoras
cualitativas y cuantitativas en las plantas y sus productos, lo cual
es de gran importancia para una población mundial cada vez más
exigente, con elevados índices de desnutrición y que va
aumentando considerablemente en el tiempo. Este trabajo es una revisión
bibliográfica sobre la aplicación de técnicas de
ingeniería genética al cultivo de café, una planta
de gran interés agronómico y comercial en el mundo.
Mejoramiento genético del café y cultivo in vitro
Dadas las características del café en cuanto a crecimiento
(planta semi-perenne de crecimiento lento que produce la primera cosecha
a partir de los 3 años de edad), el mejoramiento mediante métodos
tradicionales basados en la selección, cruces con individuos seleccionados
y propagación de dichos individuos, puede implicar largos periodos
de tiempo; por ello, la combinación de métodos de mejoramiento tradicional
y métodos de transformación genética (Agrobacterium,
biobalística o electroporación) ofrece una alternativa para
lograr el mejoramiento de esta planta (Etienne et al. 2002; Café Imperial-Venezuela,
2005).
Las técnicas de cultivo de tejidos están bien establecidas
en algunas especies de cafeto, resaltando Coffea arabica y Coffea canephora,
a partir de muestras obtenidas de la mayoría de los órganos.
La propagación puede ser mediante microesquejes (por organogénesis)
o por embriogénesis somática, siendo esta última
la principal vía de regeneración por presentar la mayor
tasa de multiplicación (Baumann y Neuenschwander 1990). Söndhal
y Mónaco (1981) y Menéndez-Yuffá et al. (1994) señalan
que este método fue establecido inicialmente por Staritsky en
1970 a partir de secciones de tallo de brotes ortotrópicos de
C. canephora, donde los embriones somáticos se formaron por embriogénesis
somática indirecta en la superficie de un callo compacto y amarillo
desarrollado por el explante; sin embargo, la frecuencia embriogénica
es mayor a partir de secciones foliares, resaltando el último
par de hojas más cercanas al ápice de la rama, las cuales
poseen mayor potencial embriogénico (Neuenschwander y Baumann
1992; Söndhal y Sharp 1977; Söndhal y Mónaco 1981).
Las hojas utilizadas como explante inicial pueden provenir de vitroplantas
o de plantas de invernadero; no obstante, se ha reportado que las primeras
ofrecen mayor rendimiento embriogénico que las segundas (Menéndez-Yuffá y
Hermoso- Gallardo 1998; Van Boxtel y Berthouly 1996).
La inducción de embriogénesis somática requiere
la combinación de una auxina y una citoquinina (la segunda en
mayor proporción respecto a la primera), aunque es posible tal
inducción con el uso de una citoquinina solamente (García
y Menéndez-Yuffá 1987; Hatanaka et al. 1991). Gatica et al. (2008a) evaluaron el efecto del triacontanol (TRIA), un alcohol vegetal
primario endógeno que incrementa el crecimiento y la productividad
al elevar la producción de ATP y la fotosíntesis, observando
que la combinación del TRIA con ácido indolacético
(AIA) aumenta la formación de embriones somáticos en C. arabica cvs. Catuaí y Caturra. Otro factor importante en la producción
de embriones somáticos es la concentración de CO2; Barbón
et al. (2008) estudiaron el efecto de este gas en la embriogénesis
somática de C. arabica cv Caturra Rojo, reportando que la concentración
más baja probada (2,5%) estimuló la producción de
embriones somáticos y su diferenciación en suspensiones
celulares embriogénicas. Explicaron que este efecto se debe a
que el CO2 modifica el pH del medio.
Los embriones formados por embriogénesis somática pasan
por los mismos estadios que los embriones cigóticos: globular,
corazón y torpedo, y la diferenciación es asincrónica
ya que suelen observarse las tres formas de embriones simultáneamente
sobre la superficie del callo. Los embriones del tipo torpedo, a punto
de entrar al estado cotiledonar, pueden dar origen a embriones somáticos
secundarios que se observan en la zona basal del hipocotilo, lo que es
indicativo del alto potencial de regeneración de este cultivo
(Menéndez-Yuffá y García 1997). Por otra parte,
en estudios sobre expresión de proteínas, se han reportado
diferencias en los patrones electroforéticos de callo embriogénico
y no embriogénico, así como entre embriones globulares,
corazón y torpedo; esto sería indicativo de una expresión
diferencial de proteínas que estaría correlacionada con
diferencias histológicas a nivel de callo y con las distintas
fases de desarrollo de los embriones somáticos (Menéndez-Yuffá et al. 1994).
En cuanto a la adaptación a tierra de las plantas obtenidas
in vitro, se ha señalado que tal adaptación es exitosa
y que el crecimiento es igual al de las plantas obtenidas a partir de
semilla (Peña 1983; Peña y Serna 1984). Sin embargo, Barry-Etienne
et al. (2002) indican que la fase de aclimatación ex vitro puede
ser problemática y ocasionar pérdidas. Es posible que esto
se relacione al uso excesivo de reguladores de crecimiento, lo que a
su vez pudiera causar alteraciones en el material genético de
las vitroplantas y afectar negativamente el proceso de adaptación
ex vitro. Al respecto, Menéndez-Yuffá y García (1998)
estudiando el material genético de plantas obtenidas in vitro,
encontraron que en casi el 80% de las células analizadas la mitosis
ocurría en forma normal; pero hubo un bajo porcentaje con alteraciones
en el número cromosómico, lo cual es desfavorable para
la conservación de las características de las plantas y
pudiera estar involucrado en las pérdidas durante la adaptación
ex vitro.
También se ha establecido con éxito el cultivo en suspensión,
en el cual se generan embriones somáticos en gran escala y se
producen metabolitos secundarios (Zamarripa 1991; Menéndez-Yuffá y
García 1998); las suspensiones celulares ofrecen ventajas como
sistema de propagación masiva de plantas por las altas tasas de
multiplicación que presentan, una mayor homogeneidad en las condiciones
de cultivo y la posibilidad de automatización (Hermoso-Gallardo
y Menéndez-Yuffá 2000). La automatización llevó al
desarrollo del Sistema de Inmersión Temporal o RITA, concebido
por el CIRAD, en el cual el contacto de los explantes con el medio de
cultivo líquido se reduce a pocos minutos por día, lo que
permite eliminar desórdenes fisiológicos ligados a la inmersión
permanente propia de los biorreactores clásicos y los frascos
Erlenmeyer, incluyendo el desarrollo asincrónico de la población
de embriones, anomalías morfológicas y heterogeneidad del
tamaño; mediante este sistema, para C. arabica, se ha señalado
la obtención de 7500 a 15000 plantas aclimatadas por gramo de
suspensión embriogénica puesto a regenerar después
de 9 meses de cultivo, de los cuales 6 transcurrieron in vitro (Etienne
et al. 1999).
Cabe destacar que el cultivo in vitro es muy importante para la preservación
del germoplasma, considerando que las semillas de café pierden
viabilidad con el tiempo. El desarrollo e implementación de esta
técnica permite mantener el germoplasma en espacios reducidos,
facilita su transporte y reduce los riesgos fitosanitarios (Menéndez
Yuffá y García 1998). Además, el cultivo de tejidos
in vitro es pilar fundamental para la regeneración y, en consecuencia,
el éxito del mejoramiento vegetal mediante transformación
genética. En el caso particular de la embriogénesis somática
secundaria, la formación de embriones somáticos secundarios
a partir de tejidos potencialmente transformados (callo embriogénico,
embriones torpedos y hojas de vitroplantas) es interesante, no solo desde
el punto de vista regenerativo, sino también por la posibilidad
de eliminar fenómenos de expresión genética en mosaico,
lo cual, según Bastar et al. (2004) se refiere a que células
individuales en tejidos vegetales transformados poseyendo la misma constitución
genética y aparentemente la misma información tejido específica,
expresen silenciamiento del gen en una parte del tejido. Tal posibilidad
tendría lugar considerando el origen unicelular de los embriones,
la formación de embriones secundarios a partir de células
potencialmente transformadas y la regeneración de plantas a partir
de estos embriones secundarios (las cuales, en consecuencia, expresarían
al transgen uniformemente).
Esto pone en evidencia la importancia de la embriogénesis somática
secundaria en los programas de mejoramiento vegetal a través de métodos
de transformación genética, puesto que las plantas transgénicas
pueden ser propagadas masivamente a partir de tejidos potencialmente transformados,
manteniendo su fidelidad genética (Fernández et al. 2005).
Características de la transformación genética
del café
A pesar del éxito reportado en relación a la introducción
de genes foráneos (reporteros y/o de selección) en café por
distintos investigadores utilizando diferentes métodos de transformación,
el registro de regeneración del material transformado y la obtención
de plantas transgénicas es limitado. Es solo en los últimos
años, después de diferentes pruebas y modificaciones que
se han realizado en las distintas metodologías, cuando se ha logrado
la regeneración del material sometido a transformación
genética.
Los estudios sobre transformación genética de café se
han llevado a cabo mediante métodos biológicos (Agrobacterium)
y métodos físicos (polietilenglicol, electroporación
y biobalística) con la finalidad de estandarizar los parámetros
de transformación y de introducir genes para la resistencia a
antibióticos, herbicidas y plagas.
Genes foráneos introducidos en café
Los genes introducidos en café para la evaluación de
métodos de transformación genética, son básicamente
de origen bacteriano (gus, nptII, hpt, bar, rol, aux, nos, cry1ac),
aunque también se han empleado genes de origen vegetal (csr 1).
El gen gus o uida obtenido de Escherichia coli es utilizado como gen
reportero, ya que permite monitorear a corto plazo el resultado del procedimiento
de transformación genética, a partir de la producción
de color en los explantes transformados consecuencia de la acción
de la enzima b-glucuronidasa (codificada por dicho gen) sobre su sustrato,
el X-gluc (5-bromo-4-cloro-3-indolyl-glucurónido). La prueba de
expresión transitoria de este gen reportero se ha realizado mediante
la reacción histoquímica GUS, según el protocolo
descrito por Jefferson et al. (1987). Esta reacción ha sido empleada
en estudios de estandarización a partir de la expresión
transgénica transitoria. Tales pruebas de estandarización
son la base para la puesta a punto de un protocolo de transformación
eficiente donde se ha maximizado la cantidad de células competentes
en las que ocurren, de manera simultánea en una misma célula,
tres procesos necesarios para obtener una planta transgénica:
transferencia del transgen al interior de la célula, integración
del transgen al ADN celular y regeneración de una planta completa
en la que se verificaron los pasos anteriores (Díaz et al. 2004).
Esto es muy importante considerando que células y explantes de
distinto genotipo, e incluso explantes diferentes de un mismo genotipo,
tienen diferente competencia o capacidad de respuesta para cada uno de
los procesos mencionados. Al respecto, Gahakwa et al. (2000) señalan
que con diversas especies vegetales, especialmente de interés
agronómico, se han realizado pruebas de transformación
con genes marcadores y reporteros, lo cual constituye en la mayoría
de los casos el primer paso para la transformación con genes de
interés; estas pruebas proveen información útil
sobre la herencia y expresión de los genes utilizados en plantas
transgénicas, pero es importante confirmar si los resultados obtenidos
usando genes marcadores o reporteros pueden ser extrapolados a genes
agronómicamente importantes. Estos autores, trabajando con arroz
y utilizando genes marcadores (bar), reporteros (gus) y con actividad
insecticida (cry1ac, cry2a) encontraron que tales resultados eran extrapolables.
Igualmente, Chen et al. (1998) reportaron una correlación positiva
entre expresión transitoria e integración estable con el
uso del bombardeo de micropartículas. Por su parte, Tian y Seguin
(2004) explican que la relación entre expresión transitoria
e integración estable de genes introducidos no es simple y que
si bien la expresión transitoria no es el único factor
determinante para la transformación estable, constituye el de
mayor peso, por lo que los resultados de pruebas de expresión
transitoria son frecuentemente utilizados como indicadores para el desarrollo
de transformación estable en muchas plantas y tejidos.
Los genes nptII y hpt se han usado como marcadores de selección
en base a la resistencia a antibióticos. El primero proviene de
E. coli y codifica a la enzima neomicina fosfotransferasa, la cual confiere
resistencia a la kanamicina y la paramomicina. Este gen fue colocado
bajo el control de un promotor no funcional en bacterias, a pesar de
lo cual es un sistema de selección altamente eficiente; esto le
confiere ventajas a nivel de bioseguridad en comparación a otros
genes de resistencia bajo el control de promotores funcionales en bacterias,
ya que se elimina el riesgo de expresión o de flujo genético
horizontal de genes de resistencia a antibióticos desde la planta
transgénica a las bacterias entéricas o del suelo. Libiakova
et al. (2001) insertaron el intrón IV2 de un gen de papa en el
centro de la secuencia codificante nptII para prevenir la expresión
de este gen procariota en bacterias entéricas y animales domésticos
como consecuencia del flujo genético desde las plantas transformadas.
Dicho intrón contiene numerosos codones de terminación
que, entonces, interrumpen el marco de lectura abierto de nptII. También
se ha señalado que este gen no es alergeno (Courvalin 1998). Por
su parte, el gen hpt codifica a la enzima higromicina fosfotransferasa
y confiere resistencia a la higromicina; proviene de la bacteria Streptomyces hygroscopicus.
Los genes bar, pat y csr1-1 confieren resistencia a herbicidas. Los
primeros provienen de S. hygroscopicus y S. viridochromogenes, respectivamente,
y codifican a la enzima fosfinotricina acetiltransferasa para la resistencia
al glufosinato de amonio, herbicida conocido como Basta o Bialaphos;
el tercero, también llamado ahas, ha sido aislado de Arabidopsis thaliana y confiere resitencia al herbicida clorosulfurón a partir
de la enzima acetolactatosintetasa.
El gen nos proviene de A. tumefaciens y los genes rol y aux provienen
de A. rhizogenes ; se han usado como marcadores de selección de
transformantes a partir de la morfogénesis.
Para la resistencia a lepidópteros, como el minador de la hoja
del café Leucoptera coffeella, se ha utilizado el gen cry1ac aislado
de Bacillus thuringiensis. En el caso particular de esta plaga, considerada
como la de mayor infestación del café arábigo (Mondragón
et al. 2004) es de gran interés la transformación genética
para su control, ya que el daño es producido en la fase de larva,
la cual tiene un desarrollo endocárpico estricto, por lo que el
rocío de formulaciones químicas pierde practicidad. Además,
se ha señalado que la proteína codificada por el gen cry1ac
es un biopesticida específicamente tóxico para larvas de
lepidópteros, inocua para el ambiente y otros seres vivos, a diferencia
del control químico que tiene un amplio rango de acción
y efectos contaminantes considerables (Guerreiro et al. 1998). La secuencia
codificante nativa del gen cry1ac ha sido modificada mediante técnicas
de Ingeniería Genética para favorecer su expresión
en plantas; esta modificación consistió en el aumento del
contenido de pares de base G+C, de 37% a 47,7%, con lo que se incrementó la
homología entre el gen y el genoma vegetal, sin alterar las características
del producto final del gen (Sardana et al. 1996).
En relación al control de la maduración del grano de
café, proceso fundamental a nivel de la calidad y el valor del
producto, se han clonado dos genes que codifican enzimas involucradas
en la síntesis de etileno, la amino 1-ciclopropano carboxílico
sintetasa o ACC sintetasa y la amino 1-ciclopropano carboxílico
oxidasa o ACC oxidasa, los cuales se perfilan como elementos claves para
el establecimiento de sistemas de transformación genética
de café con el objetivo de controlar el proceso de maduración
del grano (Pereira et al. 2005). Respecto a la tolerancia a estrés
abiótico (condiciones de sequía, salinidad, fitotoxicidad
por metales y frío,) se han producido plantas transformadas con
factores de transcripción que inducidos por cualquiera de estas
condiciones activan una familia de genes que incrementan la tolerancia
del café; esta familia incluye los genes cor15a, cor6.6, rd29A,
kin1 y rd17 (Kasuga et al. 1999).
Promotores y terminadores
Los genes introducidos al café en los estudios de transformación
genética han sido colocados bajo el control de promotores constitutivos,
como el CaMV35S y EF1α. Es importante considerar que a pesar de
que los promotores constitutivos actúan en todos los tejidos, cada vez
que se insertan genes regulados por este tipo de promotores se observan
diferencias en cuanto a la especificidad para el tejido o el grado de
expresión de los genes bajo su control. En consecuencia, aún
cuando se activan los genes, no siempre se activan en el mismo grado
en todos los tejidos (Rodríguez y Chamberlin 1982). El EF1α ha
sido obtenido de A. thaliana. El más utilizado ha sido el promotor
35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV35S), considerado como
un promotor fuerte (también puede regular la expresión
genética en organismos no relacionados). El CaMV es el principal
miembro de los caulimovirus, que además son los únicos
virus vegetales conocidos que poseen ADN de doble cadena. Ha mostrado
ser menos eficiente en la transformación de monocotiledóneas
del tipo cereales, en las cuales han resultado más efectivos los
promotores Act I de arroz y Ubi I de maíz. El efecto contrario
se ha reportado para monocotiledóneas no cereales, donde la efectividad
del promotor CaMV35S incrementa considerablemente cuando se le emplea
duplicado (Kanno et al. 2000). En este sentido, la duplicación
de dicho promotor parece tener un efecto intensificador sobre su función
a nivel de expresión. A pesar de que el promotor CaMV35S es, al
parecer, más fuerte que otros promotores constitutivos, los promotores
Act I y Ubi I tienen la ventaja, desde el punto de vista de la bioseguridad,
de ser de origen vegetal; algunos investigadores también han reportado
que, si bien el número de transformantes iniciales obtenidos con
el promotor CaMV35S es más elevado que con el Ubi I o el Act I,
con el primero pudiera ser igualmente mayor el eventual silenciamiento
observado (Dahleen et al. 2001).
Leroy et al. (2000) trabajando en transformación de café utilizaron
el promotor CaMV35S duplicado, con lo cual reportaron un efecto intensificador
en la regulación de la expresión del gen csr1-1 aislado
de A. thaliana, el cual confiere resistencia al herbicida clorosulfurón,
que fue usado como marcador de selección. También usaron
el promotor EF1α de A. thaliana, cuya eficiencia ya había
sido probada por Van Boxtel et al. (1995), junto con la secuencia
intensificadora llamada Ω' derivada del virus del mosaico del
tabaco. Sin embargo, la eficiencia de transformación fue mayor
con el promotor CaMV35S duplicado.
Por su parte, Van Boxtel (1994) y Van Boxtel et al. (1995), colocaron
al gen reportero gus bajo el control de los promotores EF1α, CaMV35S
y Ubi I de maíz, encontrando un incremento de la expresión
transitoria con el primero, en comparación a lo observado con
los otros dos.
También se han realizado ensayos con promotores propios del café,
incluyendo el promotor de la α-tubulina (nro. de accesión al Genbank
AF363630) y de la proteína de almacenamiento 11S de C. arabica
(nro. de accesión al Genbank AF055300), para dirigir la expresión
del gen gus en suspensiones celulares transformadas por biobalística,
obteniéndose resultados similares en comparación a la expresión
observada al utilizar el promotor CaMV35S, pero con las ventajas que
ofrece el uso de secuencias propias de la planta al nivel de bioseguridad
(Rosillo et al. 2003).
En cuanto a las secuencias terminadoras, se ha utilizado frecuentemente
el terminador de la nopalina sintetasa NOS de Agrobacterium.
Métodos utilizados en la transformación genética
de café
Como se mencionó, la transformación genética de
café se ha llevado a cabo mediante métodos físicos
y biológicos que incluyen Agrobacterium, polietilenglicol, electroporación
y biobalística.
De Peña (1995) y Carneiro (1999) hacen referencia a la transformación
de protoplastos de C. arabica cv. Colombia mediante tratamiento con polietilenglicol,
registrándose expresión transitoria del gen reportero gus
y resistencia a la kanamicina a partir de la expresión del gen
nptII utilizado como marcador de selección. Sin embargo, no se
reporta regeneración de plantas transformadas. Esto probablemente
se deba a la vulnerabilidad de los protoplastos; en este sentido, Díaz
et al. (2004) explican que el cultivo de protoplastos es la metodología
más sofisticada del cultivo in vitro de plantas por lo cual representa
gran complejidad experimental, no estando disponible más que para
algunas especies y, dentro de ellas, particularmente en genotipos modelo.
Por ello se desarrollaron metodologías alternativas de transformación
directa, como electroporación y bombardeo de micropartículas
o biobalística.
La transformación de protoplastos de café también
se ha llevado a cabo mediante electroporación. Barton et al. (1991)
electroporaron protoplastos de C. arabica, reportando la obtención
de embriones somáticos transformados y la regeneración
de plantas que fueron seleccionadas en base a la resistencia a kanamicina.
Sin embargo, estas plántulas no sobrevivieron debido a un sistema
radicular pobremente desarrollado. Van Boxtel (1994) señala la
expresión del gen gus en distintos genotipos electroporados de
café, pero sin la sobrevivencia del material regenerado. Por otra
parte, Fernández y Menéndez (2003) optimizaron los parámetros
de transformación de tejidos intactos de café mediante
electroporación, reportando la regeneración del material
transformado con resultados positivos en la reacción GUS y en
la PCR para los genes introducidos (gus y bar); los mejores resultados
fueron obtenidos al electroporar embriones torpedos que previamente fueron
tratados para la digestión parcial de la pared celular.
La transformación por biobalística se ha llevado a cabo
con los genes gus, bar y ahas, con resultados positivos en la expresión
transitoria del gen gus y en la PCR para los genes introducidos. Van
Boxtel et al. (1995) evaluaron los parámetros de transformación
de café mediante biobalística en base a la expresión
transitoria del gen reportero gus. Ellos probaron varios explantes (callo,
suspensiones celulares, hojas de vitroplantas y de plantas de invernadero,
embriones somáticos y suspensiones celulares); también
probaron el efecto de incubaciones pre bombardeo con antioxidantes (cafeína,
polivinilpirrolidona y sulfito de sodio) y post bombardeo con auxinas
en la expresión transitoria de dicho gen. Ninguno de los antioxidantes
probados favoreció tal expresión. Los mejores resultados
los obtuvieron al usar hojas de vitroplantas, dadas las características
morfológicas y regenerativas de este explante. La incubación
post bombardeo en medio líquido suplementado con una auxina favoreció tanto
la recuperación del material bombardeado como la expresión
del gen gus, debido a una reducción en la oxidación y la
necrosis tisular. Se ha señalado que esta incubación disminuye
la oxidación del tejido después del bombardeo al disminuir
la liberación de polifenoles y favorecer la recuperación
frente al daño mecánico sufrido; también puede realizarse
antes del bombardeo, como un pretratamiento osmótico dirigido
a facilitar la penetración de las micropartículas. La incubación
en medio líquido posterior al procedimiento de transformación
también fue señalada como favorable por Fernández
y Menéndez (2003) en la recuperación y regeneración
de explantes de café transformados por electroporación,
al permitir un mejor intercambio gaseoso, uniformidad en la disponibilidad
de nutrientes y rápida incorporación de estos y otros metabolitos
a las células, así como la difusión al medio de
compuestos fenólicos que pudieran interferir negativamente en
la activación del potencial embriogénico del tejido.
Rosillo et al. (2003) bombardearon suspensiones celulares de C. arabica
cv. Colombia con plásmidos de la serie pCAMBIA (Centre for the
Application of Molecular Biology to International Agriculture-Canberra,
Australia), variando parámetros físicos en la pistola de
bombardeo (distancia hasta el explante y presión de helio) y la
duración y concentración de tratamientos osmóticos
prebombardeo. Reportan expresión transitoria del gen reportero
gus, la cual incrementó considerablemente en el material preincubado
durante 4 horas con manitol y sorbitol, bombardeado a 900 psi con una
distancia de 9 cm o 1550 psi con 12 cm de distancia. Sin embargo, no
reportan la regeneración de plantas. Gatica-Arias et al (2008b)
también bombardearon agregados de suspensiones celulares de C. arabica cvs Caturra y Catuaí con el gen gus, y lograron la regeneración
vegetal via embriogénesis somática indirecta.
Barros et al. (2001) realizaron la transformación mediante biobalística
de embriones cigóticos de C. arabica con el gen ahas, logrando
la selección del material transformado en base a la resistencia
al herbicida Imazapyr, pero tampoco lograron la obtención de plantas.
Cunha et al. (2004) señalan la transformación de callo
embriogénico de C. arabica utilizando los genes gus y nptII, con
la selección de callo transformado en base a la resistencia a
kanamicina y la regeneración de plantas que fueron positivas en
la expresión transitoria del gen reportero y en la PCR para los
genes foráneos. Ribas et al. (2005) también reportan la
regeneración de plantas resistentes al herbicida Basta, a partir
del bombardeo de explantes de C. canephora con los genes gus y bar.
En cuanto a la transformación por Agrobacterium, se han utilizado
las especies tumefaciens y rhizogenes, utilizando genes propios de estas
bacterias, así como foráneos (gus, nptII, hpt, csr1
y cry1ac).
Ocampo y Manzanera (1991) lograron la infección de hipocótilos
de C. arabica germinados de semillas in vitro con A. tumefaciens, sin
la regeneración de plantas. Spiral et al. (1993) transformaron
embriones somáticos torpedos de C. canephora (a los que se les
hizo cortes superficiales con un bisturí) usando A. rhizogenes
portando los genes gus y bar; reportaron la obtención de plantas
positivas en la prueba histoquímica GUS y en la PCR para los genes
mencionados. Sugiyama et al. (1995) reportaron la transformación
de café con el gen rol de A. rhizogenes, cuya presencia en los
tejidos transformados fue confirmada mediante PCR; sin embargo, no lograron
la regeneración de plantas. Hatanaka et al. (1999) transformaron
callo embriogénico de C. canephora y Leroy et al. (2000) transformaron
distintos explantes de C. arabica y C. canephora con A. tumefaciens portando
los genes gus, nptII, cry1ac y csr1, logrando la regeneración
de plantas con evaluación positiva a nivel de expresión
transitoria GUS y PCR y Southern Blot para los genes involucrados. Kumar
et al. (2006) describen la transformación de C. canephora con
A. rhizogenes portando los genes gus y hpt, logrando la regeneración
del material transformado sin el fenotipo de raíz en cabellera
y con evaluación positiva para la resistencia al agente de selección,
la prueba histoquímica GUS y mediante PCR. Por su parte, Alpizar
et al. (2008) transformaron C. arabica utilizando A. rhizogenes y observaron
la integración de los oncogenes rol y aux del T-DNA del plásmido
Ri en la evaluación de la transformación por PCR.
Selección del material transformado
Esta selección se produce generalmente a partir de un gen marcador
de resistencia a un antibiótico o a un herbicida, el cual cumple
un papel muy importante en el proceso de transformación genética,
ya que le confiere a las células transformadas, con respecto a
las no transformadas, la ventaja de crecer en presencia del agente de
selección correspondiente. Como algunas especies pueden poseer
resistencia natural a un agente de selección dado, es importante
escoger el agente y la magnitud de la presión selectiva adecuados
para la especie de interés, independientemente del sistema de
transformación que se utilice.
Van Boxtel et al. (1997) evaluaron el efecto de 5 agentes de selección,
incluyendo resistencia a herbicidas y a antibióticos (clorosulfurón,
glifosato, glufosinato de amonio, higromicina y kanamicina) en explantes
de diferentes genotipos de café. Encontraron que 100 mg L-1 de
kanamicina y 3 mg L-1 de glufosinato inhibieron el crecimiento de suspensiones
embriogénicas de C. canephora. Concentraciones mayores a 90 mg
L-1 de glifosato no inhibieron el crecimiento del callo o de las suspensiones.
Con la kanamicina la inhibición fue variable, mientras que la
higromicina y el clorosulfurón causaron una fuerte necrosis en
callo. Concluyeron que la sensibilidad a los agentes selectivos era genotipo
dependiente y que el glufosinato de amonio era el agente más efectivo
en la inhibición de la formación y crecimiento de callo
en secciones foliares de C. arabica, Arabusta (híbrido de C. arabica
y C. canephora cv. Robusta) y C. canephora, con ausencia de necrosis
tisular; Arabusta mostró la mayor resistencia a los distintos
agentes probados, en tanto que C. canephora mostró la mayor sensibilidad.
Giménez et al. (1996) evaluaron el nivel de resistencia a kanamicina
de distintos explantes de C. arabica. Encontraron que 25-30 mg L-1 del antibiótico
inhibían la germinación de los embriones y que las hojas se afectaban
con concentraciones más bajas, mientras que las suspensiones celulares
eran prácticamente insensibles (la inhibición se observó en
concentraciones superiores a los 300 mg L-1). Para el callo, la inhibición
se observó al utilizar 100 mg L-1 de kanamicina. Los autores concluyeron
que el gen nptII puede ser utilizado como marcador de selección efectivo
en hojas y embriones somáticos de C. arabica, realizando la selección
en medio solidificado con agar. Por su parte, Hatanaka et al. (1999) y Ogita
et al. (2004) emplearon exitosamente la higromicina como agente selectivo de
embriones somáticos transformados. Leroy et al. (2000) seleccionaron
tejido embriogénico transformado en base a la resistencia al herbicida
clorosulfuron y Ribas et al. (2005) en base a la resistencia al glufosinato.
En cuanto a selección positiva, Samson et al. (2004) evaluaron
la capacidad de crecimiento de distintos genotipos de café en
medios con manosa o xilosa como fuente de carbono. Observaron el crecimiento
y la formación de embriones somáticos en presencia de manosa,
pero no en presencia de xilosa, lo cual señala al gen de la xilosa
isomerasa xyla de Streptomyces rubiginosus como un posible marcador de
selección positiva en el mejoramiento de café mediante
transformación genética. Este gen ya ha sido utilizado
con éxito en sistemas de transformación de papa, tabaco
y tomate (Bailey y Kaeppler, 2001).
Contenido de cafeína e ingeniería genética
La ingeniería genética también ha sido utilizada
para modificar el contenido de cafeína, lo cual es importante
considerando la sensibilidad de algunos consumidores a este alcaloide
y que el café descafeinado ha superado el 10% del café comercializado
en el mundo (Silvarolla et al. 2004; NCA 2009). Ogita et al. (2003) utilizaron
la tecnología del ARN de interferencia ARNi para la obtención
de plantas transgénicas con una tasa de síntesis de cafeína
reducida. Las funciones fisiológicas del sistema ARNi son variadas;
actúa como un mecanismo importante en la regulación de
la expresión genética endógena, en el mantenimiento
de la población de células madre embrionarias por medio
de procesos desconocidos, como sistema de defensa contra virus, control
de transposones o elementos genéticos anómalos, a nivel
terapéutico para silenciar ARNm virales y oncogénicos,
como herramienta de estudio de la función celular y en la identificación
de genes esenciales en procesos celulares (Ruíz y Muñoz,
2005). Ogita et al. (2003) mediante esta técnica inhibieron la
expresión de un gen (CaMXMT1) que codifica a una de las enzimas
N-metiltransferasas (theobromine synthasa) involucrada en la biosíntesis
de la cafeína, utilizando 2 vectores ARNi idénticos con
el fragmento espaciador del gen gus bajo el control del promotor CaMV35S
y el terminador de la nopalina sintetasa NOS. En C. canephora el contenido
final de cafeína se redujo por encima del 70% y en C. arabica
entre un 65-85%.
Pruebas en campo de plantas transgénicas de café
El primer reporte de plantas transgénicas de café con
una característica agronómicamente importante (resistencia
al minador de la hoja del café) probadas en invernadero y en campo
ha sido realizado por Leroy et al. (2000). En invernadero realizaron
bioensayos, exponiendo las plantas seleccionadas en base a la resistencia
al agente de selección, la detección de la proteína
cry1ac en extractos foliares mediante Western Blot y la evaluación
positiva a nivel de ADN (PCR y Southern Blot), a las larvas del insecto,
encontrándose una considerable reducción en el número
de minas y en la defoliación en las plantas transgénicas,
en comparación a lo observado en las no transgénicas (plantas
controles). Las plantas que mostraron alta resistencia al minador en
las pruebas realizadas en invernadero, fueron seguidamente evaluadas
en campo en la Guayana Francesa durante 4 años consecutivos, encontrándose
que el 70% de las plantas fue resistente a la plaga en estas condiciones.
No se evidenciaron diferencias entre el crecimiento de estas plantas
con respecto al de las plantas controles durante el periodo de estudio.
Sin embargo el experimento fue interrumpido forzosamente debido a la
acción de grupos ecologistas (CIRAD 2001; Perthuis et al. 2005).
Actualmente no existen medidas regulatorias internacionales para café modificado
genéticamente. Sin embargo, hay un amplio consenso en la industria
cafetalera para evitar su comercialización e incentivar la investigación
y búsqueda de conocimiento en relación con el genoma de
café, incluyendo el análisis funcional de sus genes mediante
el uso de metodologías transgénicas (Etienne et al. 2008).
CONCLUSIÓN
La Ingeniería Genética ha permitido ampliar el campo del
mejoramiento vegetal a partir del manejo y la transferencia de genes
de interés, aplicándose especialmente en plantas de importancia
agronómica y comercial, como el café. Esta planta ha sido
la base de estudios y pruebas que incluyen el cultivo in vitro y la transformación
genética con métodos físicos y biológicos,
logrando la expresión de genes foráneos (de origen vegetal
y bacteriano) y la modificación de la expresión de genes
endógenos (como los que regulan la maduración del grano
y el contenido de cafeína). El fruto de estas investigaciones
puede ser utilizado para incrementar la producción, el rendimiento
y la calidad de esta planta de gran demanda internacional, e incluso
para estimular y potenciar su cultivo en países con tradición
cafetalera, como Venezuela. Sin embargo, es necesaria la creación
de un marco legal y de regulación nacional e internacional para
el café transgénico, de manera que ninguno de los eslabones
de la industria cafetalera, desde el cultivo como tal, pasando por los
pequeños, medianos y grandes productores, hasta llegar al consumidor,
se vean perjudicados.
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Copyright 2009 - Revista Científica UDO Agrícola
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