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African Crop Science Journal
African Crop Science Society
ISSN: 1021-9730 EISSN: 2072-6589
Vol. 10, Num. 3, 2002, pp. 221-229

African Crop Science Journal, Vol. 10. No. 3, 2002, pp. 221-229

EFFET DE NaCl SUR L’EMBRYOGENESE SOMATIQUE ET SUR LES CAPACITES DE REGENERATION CHEZ LE BLE. ETUDE DE LA COMPETENCE EMBRYOGENE DES CULTURES DE BLE INITIEES DIRECTEMENT EN PRESENCE DE NaCl

F. Oudija et M. Ismaili

Laboratoire de Physiologie Végétale et d’amélioration génétique des plantes, Département de Biologie, Université My Ismail, Faculté des sciences, B.P. 4010.  Meknès, Maroc

(Received 28 July, 2001; accepted 13 May, 2002)

Code Number: cs02022 

RÉSUMÉ

Deux variétés de blé dur Triticum durum (Karim et Sebou) et deux variétés de blé tendre Triticum aestivum (Sais et Merchouch) utilisées dans l'agriculture du Maroc, ont été testées pour leur tolérance à la salinité en culture in vitro. L’application du stress salin a été effectuée à la phase d’initiation des cals. L’étude des compétences callogènes et embryogènes et du pouvoir de régénération des cals a montré que l’augmentation des concentrations en sel a provoqué une diminution progressive de la germination zygotique, du pourcentage des cals embryogènes  et  du  taux  de  callogenèse,  à  partir  de  la  concentration  10 g l-1  de  NaCl (P < 0 ,0001). Cependant, les milieux de culture contenant les concentrations les plus élevées (15 et 20 g l-1 de NaCl) maintiennent un taux assez élevé de cals embryogènes. Les cals initiés sur le milieu additionné de 20 g l-1 de NaCl présentent le taux de régénération le plus faible. On note aussi dans ces milieux, la présence de plantes albinos qui n’ont aucune valeur en amélioration des plantes.

Mots Clés: callogenèse, embryogenèse, NaCl, régénération, salinité, stress, tolérance, Triticum aestivum, Triticum durum

ABSTRACT

Two durum wheat (Karim and Sebou)  and two soft wheat (Sais and Merchouch) varieties, used in Morocco were tested in vitro for their salinity tolerance. Salt stress was applied during calli initiation stage. Increasing salt concentration up to 10 g l-1 resulted in a gradual decrease of zygotic germination (P<0.0001), embryogenesis calli (P< 0.0001) and callogenesis rates (P< 0.0001). However in culture media with high salt concentration (15 and 20g/l), embryogenesis calli rate remained high. Salt affected regeneration even when, at this stage, the culture medium was deprived of salt. Indeed, calli which had been initiated in 20 salt g l-1, had the lowest regeneration rate. This concentration resulted in worthless albino seedlings.

Key Words: Callogenesis, embryogenesis, NaCl, regeneration, salinity, stress, tolerance,   Triticum aestivum, Triticum durum

INTRODUCTION

Le stress est défini comme l’action d’un facteur de l’environnement (ou la combinaison de plusieurs d’entre eux) limitant la réalisation des potentialités génétiquement déterminées de croissance, de développement et de reproduction chez les plantes (Levitt, 1980). Les problèmes causés par le stress salin sont fréquents à travers le monde et en particulier en zones méditerranéennes. Le Maroc, dont le climat est aride et semi- aride, est menacé par la salinisation. Ce problème s’accentue avec l’extension des superficies irriguées  (Ftouhi, 1981). Chez le blé, les dégâts produits par le stress salin se manifestent communément par une séquence de changements morphologiques et physiologiques.

Les techniques de culture in vitro des tissus végétaux ont pris une importance croissante dans le programme d'amélioration des plantes cultivées pour la sélection de lignées cellulaires tolérantes à la salinité (Dix, 1980; Kochba et al., 1982). Chez les céréales, les protocoles de sélection ont été appliqués à partir de différents explants (embryons matures ou immatures, anthères, suspensions cellulaires, …); ou sur des cals initiés à partir de ces explants (Li su et Heszki, 1986; Dekeyser et al., 1987; Zair et al., 1994). Chez le blé, les embryons immatures produisent des cals embryogènes de manière reproductible et à haute fréquence. Après transfert sur le milieu de régénération, ces cals ont des capacités élevées pour la formation de multiples plantules (Mathias et Simpson, 1986; He et al., 1986, 1988, 1990; Carman et al., 1987a, b). La pression sélective peut être appliquée pendant la phase de callogenèse et /ou de régénération. Quand la présence du sel n'interfère pas avec le processus de régénération lui même, comme dans le cas de l'embryogenèse (Rangan et Vasil, 1983; Chandler et Vasil, 1984), la présence de l'agent de sélection dans le milieu de régénération peut augmenter la probabilité de régénérer des plantes tolérantes (Nabors et al., 1980).

En général, le stress peut s'appliquer lors de l'initiation des cals, à partir d'embryons mûrs ou immatures, ou sur des cals d'un certain âge obtenus en conditions non sélectives. Les cals continuant à proliférer en présence de l'agent sélectif sont considérés comme tolérants au stress. La pression de sélection s'exerçant sur les cals est généralement de longue durée, parce que toutes les cellules ne sont pas uniformément exposées à l'agent sélectif: les cellules qui ne sont pas en contact direct avec l'agent stressant peuvent échapper à la pression sélective, ce qui peur entraîner la régénération de  plantes sensibles ou chimériques. Ce qui explique pourquoi la plupart des travaux de sélection in vitro utilisent la sélection de longue durée. Or, chez les cultures de cals de blé, les périodes de rétention de la capacité de régénération sont relativement courtes (Sears et al., 1981, Ahloowalia, 1982; Chen et al., 1985).

Ainsi, au cours de notre étude, on s’est intéressé à l’étude de l’embryogenèse somatique et des capacités de régénération chez les cals de blé initiés directement sur le milieu de culture contenant différentes concentrations en NaCl dans le but de sélectionner de nouveaux cultivars mieux adaptés à la salinité.   

MATERIEL ET METHODES

Matériel végétal.  Nous avons utilisé deux variétés de blé dur (Karim et Sebou) et deux variétés de blé tendre (Sais et Merchouch). Les graines sont fournies par l’Institut National de Recherche Agronomique de Meknès (Maroc). Les plantes mères ont été cultivées au champ, sous des conditions naturelles. Les épis ont été prélevés 14 à 20 jours après l’anthèse. A ce stade, les embryons immatures ont une longueur de 1,5 à 2 mm et montrent une bonne morphogenèse in vitro (Bennici et al., 1988).

La stérilisation a été effectuée par passage des embryons immatures dans un bain d’éthanol (95°) pendant 30 mn, suivi d’un bain d’hypochlorite de calcium (33 %) pendant 15 mn. Les embryons ont été ensuite rincés dans de l’eau distillée stérile pendant 5 mn.

Milieux de culture. Pour la callogenèse, le milieu de base utilisé est celui de Murashige et Skoog (1962). Il se compose de macroéléments, de microéléments, de sels minéraux et de vitamines et a été  additionné de 30 g l-1 de saccharose, de 2 mg l-1 de 2,4 D (acide 2,4-dichloro-phenoxyacétique) et de différentes concentrations en NaCl (0 – 2,5 – 5 – 10 – 15 et 20 g l-1). Ce milieu a été ensuite solidifié par 7 g /l d’agar. Le pH a été ajusté à 5,8 avant l’autoclavage.

Les cals initiés sur MS + NaCl ont été transférés sur le milieu de régénération dépourvu de sel. La différenciation des embryons somatiques et leur développement en plantules se fait de la même manière pour tous les cals issus des différents traitements. Après 5 semaines sur le milieu de régénération, le nombre moyen de plantules par cal régénérant ainsi que le pourcentage de régénération ont été évalués pour les quatre cultivars.

Conditions de culture. Les cultures d’embryons immatures sont soumises à l’obscurité continue à une température de 25 ± 2°C le jour et 18 ± 2°C la nuit dans une chambre de culture pour l’induction de la  callogenèse. Les cals sont ensuite transférés dans des bocaux de régénération soumis à une photopériode de 16 h d’éclairement.

Evaluation des résultats. Après 5 semaines de culture, on procède à la détermination du:

  • pourcentage zygotique des cals;
  • pourcentage de callogenèse (mesuré par le nombre total d'explants ayant formé des cals par rapport au nombre total d'explants mis en culture);
  • pourcentage de cals embryogènes (exprimé par le nombre de cals embryogènes par rapport au nombre total de cals de la variété).

La régénération est estimée après cinq semaines de culture sur le milieu de régénération par :

  • Le pourcentage de régénération qui est déterminé par le nombre de cals ayant régénéré au moins une plantule par rapport au nombre total de cals mis en régénération.
  • Le nombre moyen de plantules par cal régénérant.
  • Le nombre moyen de plantules régénérées.

Analyses statistiques. Les résultats obtenus ont été soumis à l’analyse de la variance et à la comparaison des moyennes par le test LSD en utilisant le logiciel " SAS" (SAS, 1988). Une régression a été aussi  appliquée sur les données afin de corréler certaines variables.

RESULTATS

Effet de NaCl sur la callogenèse 

Germination de l’embryon zygotique. Le stress salin a affecté significativement (P< 0,0001) la germination des explants des divers cultivars (Fig. 1). L’augmentation du stress salin dans le milieu se traduit par une diminution progressive et significative de la germination zygotique à partir de 10 g l-1  (Tableau 2) et tend à disparaître à 20 g l-1.

Induction de la callogenèse. Le taux de  callogenèse est de 100 % pour le témoin et la concentration 2,5 g l-1 de NaCl chez toutes les variétés (Fig. 2). A 5 g l-1, plus de 80 % des explants sont callogènes aussi bien pour le blé dur que pour le blé tendre. A partir de 10 g l-1 de NaCl, le taux de callogenèse diminue mais reste quand même important sur le milieu contenant 15 g l-1. A 20 g l-1, on enregistre le pourcentage le plus faible de callogenèse comparé à celui du témoin. Les cals formés sont de petite taille et seules les variétés Sais et Merchouch forment des cals globuleux.

L'action du sel s'est donc traduite par une diminution progressive et significative du taux de callogenèse (Tableau 2).

Effet sur le taux de cals embryogènes. D’après le graphique de la Figure 3, on constate que le taux de cals embryogènes le plus élevé a été obtenu avec le milieu témoin et celui contenant 2,5 g l-1 de NaCl.  Par la suite, les compétences embryogènes des explants diminuent significativement avec l’augmentation du sel dans le milieu de culture (Tableau 2).  Cette baisse est plus accentuée chez le blé dur que chez le blé tendre.

Les embryons cultivés dans MS + 15 g et MS + 20 g l-1 de NaCl, présentent le pourcentage le plus bas de cals embryogènes.  Cependant, celui - ci reste relativement important.  On note aussi dans ces milieux la présence d’embryons somatiques de petite taille et dispersés dans une masse de cals non embryogènes.

Etude de la régénération des cals initiés sur MS supplémenté de différentes concentrations de NaCl 

Taux de régénération.  Les cals initiés sur MS, MS + 2,5 g l-1, MS + 5 g l-1 et MS + 10 g l-1 de NaCl et transférés sur le milieu de régénération sans sel, présentent de bons pourcentages de régénération (Fig. 4). On assiste aussi à la régénération de cals initiés sur MS + 20 g l-1 de NaCl où l’on note les pourcentages les plus faibles comparés à ceux des témoins. Sous l’effet du sel, les explants ont perdu une plus grande partie de leur pouvoir de régénération et de leurs capacités à former des plantules. Des plantes albinos ont aussi été régénérées à partir des cals initiés  sur 15 et 20 g l-1 de NaCl.

Nombre moyen de plantules par cal régénérant.  Les observations effectuées lors de la période de régénération ont permis de constater que les nombres moyens de plantules par cal régénérant (NMPR) les plus faibles sont obtenus dans le cas de la régénération des cals initiés dans les fortes concentrations en NaCL (20 g l-1) pour toutes les variétés (Tableaux 1). D’autre part, 70 % des plantules régénérées dans ces milieux de culture sont albinos (Photo 1). Il est arrivé parfois que les cals ne produisaient que des racines (Photo 2) ou ne montrent aucune morphogenèse et finissent par se nécroser. Par ailleurs, dans les faibles concentrations (2,5 et 5 g l-1 de NaCl), les cals régénérant présentent des plantules qui ont induit rapidement des racines bien développées et sont facilement séparables les unes des autres. On peut donc conclure que dans ce dernier cas, la régénération a bien eu lieu via l’embryogenèse somatique.

DISCUSSION ET CONCLUSION        

Chez les  céréales, des protocoles de sélection de génotypes tolérants  à la salinité ont été réalisés en adoptant les techniques de culture in vitro (Dix, 1980; Kochba et al., 1982). L’outil remarquable que constituent ces techniques est d’une signification particulière pour l’ amélioration des cultures de blé. Parmi ces nouvelles techniques l’obtention d’une embryogenèse somatique  in vitro par culture d’embryons matures ou immatures, d’anthères, de suspensions cellulaires ou d’inflorescences (Li su et al., 1986; Dekeyser et Bouharmont, 1987). C’est surtout l’embryon immature qui a retenu au maximum l’intention des chercheurs (Sears et Deckard, 1982; Ozias-Akins et Vasil, 1983c; Maddock et al., 1983; He et al., 1986). La pression sélective du sel est dans la majorité des cas, appliqué d’emblée dans des conditions qui provoquent une inhibition marquée de la croissance du génotype sauvage (Jacobs, 1988).

L’action de l’agent stressant pendant la phase de callogenèse peut avoir lieu à différentes phases de croissance des cals, après leur initiation sur un milieu dépourvu de sel Hasegawa et al., 1980; Ben-Hayyim et Kochba, 1982); ou à la phase d’initiation des cals (Smith et McComb, 1981; Zair, 1996).

La pression peut également être exercée graduellement, en palier, en augmentant la concentration de l’agent stressant au cours des repiquages successifs des colonies survivantes Meredith, 1984). Cette  pression sélective graduelle peut cependant favoriser des mécanismes d’adaptation physiologiques (Mchughnen et al., 1984, 1987) qui ne manifestent plus leurs effets au niveau des plantes régénérées, ce qui n’est pas souhaitable dans un programme de sélection.

Dans notre étude, on s’est int’ress à l’application du stress salin à la phase d’initiation des cals. En effet, le sel a provoqué une réduction progressive et significative de l’embryogenèse des explants. On a constaté aussi que les cals formés ont montré une meilleure résistance comparée à celle des cals initiés sur MS puis repiqués sur le milieu contenant le sel. Ceci pourrait s’expliquer par le fait que l’application du sel en phase d’initiation des cals pourrait provoquer des mutations qui conduiraient à la formation de lignées cellulaires tolérant mieux le chlorure de sodium. Ces résultats confirment ceux d’Abrigo et al., 1985) qui ont montré que la résistance de la plante au sel se trouve principalement au niveau cellulaire. Eventuellement, cette approche pourrait entraîner un certains nombres de caractères non désirés ou même défavorables. le choix du moment d’application du stress salin aux différentes variétés est important pour l’acquisition de la tolérance Bodson et al., 1986; Oudija et al., 2001).

D’autres part, les travaux de certains chercheurs Rahman et Kauls, 1989; Zair et al., 1996) ont montré que l’addition de l’acide ascorbique aux milieux de culture contenant de fortes concentrations en NaCl était nécessaire à l’initiation d’un cal embryogène. Par contre Smith et McComb 1981), en initiant des cals directement en présence de sel, ont montré que l’initiation ainsi que la croissance des cals variaient avec le niveau de NaCl dans le milieu de culture. Ce qui confirme les résultats obtenus dans notre étude.

L’effet de la salinité s’est répercuté aussi sur le taux de régénération même si le milieu de culture ne contenait pas de sel. Ceci montre que la tolérance différentielle des plantes à la salinité est sous contrôle génétique (Epstein et al., 1980). Les bases de ce processus ne sont pas très claires. Les résultats obtenus par Gorham (1987), ont montré l’effet majeur d’un ou plusieurs gènes (localisé sur le long bras du chromosome 4D), sur la capacité du blé à discriminer entre le sodium et le potassium pour l’absorption et le transport vers les parties aériennes.

On peut donc conclure qu’en conditions de stress salin, on assiste à une réduction de l’embryogenèse somatique et des capacités de régénération. Ces compétences dépendent à la fois du génotype et de la concentration en NaCl dans le milieu de culture et ne diminuent significativement qu’ à partir de 2,5 g l-1 chez toutes les variétés étudiées. L’application du stress pendant la phase d’ initiation des cals permet la régénération de plantules de meilleures performances.

REMERCIEMENTS    

Nous tenons à remercier monsieur Mohammed Diouri, Professeur  à la Faculté des Sciences de Meknès pour son aide dans la réalisation des analyses statistiques et pour la lecture critique de ce manuscrit.

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