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African Crop Science Journal, Vol. 10. No. 3, 2002, pp. 221-229 EFFET DE NaCl SUR LEMBRYOGENESE SOMATIQUE ET SUR LES CAPACITES DE REGENERATION CHEZ LE BLE. ETUDE DE LA COMPETENCE EMBRYOGENE DES CULTURES DE BLE INITIEES DIRECTEMENT EN PRESENCE DE NaCl F. Oudija et M. Ismaili Laboratoire de Physiologie Végétale et damélioration génétique des plantes, Département de Biologie, Université My Ismail, Faculté des sciences, B.P. 4010. Meknès, Maroc (Received 28 July, 2001; accepted 13 May, 2002) Code Number: cs02022 RÉSUMÉ Deux variétés de blé dur Triticum durum (Karim et Sebou) et deux variétés de blé tendre Triticum aestivum (Sais et Merchouch) utilisées dans l'agriculture du Maroc, ont été testées pour leur tolérance à la salinité en culture in vitro. Lapplication du stress salin a été effectuée à la phase dinitiation des cals. Létude des compétences callogènes et embryogènes et du pouvoir de régénération des cals a montré que laugmentation des concentrations en sel a provoqué une diminution progressive de la germination zygotique, du pourcentage des cals embryogènes et du taux de callogenèse, à partir de la concentration 10 g l-1 de NaCl (P < 0 ,0001). Cependant, les milieux de culture contenant les concentrations les plus élevées (15 et 20 g l-1 de NaCl) maintiennent un taux assez élevé de cals embryogènes. Les cals initiés sur le milieu additionné de 20 g l-1 de NaCl présentent le taux de régénération le plus faible. On note aussi dans ces milieux, la présence de plantes albinos qui nont aucune valeur en amélioration des plantes. Mots Clés: callogenèse, embryogenèse, NaCl, régénération, salinité, stress, tolérance, Triticum aestivum, Triticum durum ABSTRACT Two durum wheat (Karim and Sebou) and two soft wheat (Sais and Merchouch) varieties, used in Morocco were tested in vitro for their salinity tolerance. Salt stress was applied during calli initiation stage. Increasing salt concentration up to 10 g l-1 resulted in a gradual decrease of zygotic germination (P<0.0001), embryogenesis calli (P< 0.0001) and callogenesis rates (P< 0.0001). However in culture media with high salt concentration (15 and 20g/l), embryogenesis calli rate remained high. Salt affected regeneration even when, at this stage, the culture medium was deprived of salt. Indeed, calli which had been initiated in 20 salt g l-1, had the lowest regeneration rate. This concentration resulted in worthless albino seedlings. Key Words: Callogenesis, embryogenesis, NaCl, regeneration, salinity, stress, tolerance, Triticum aestivum, Triticum durum INTRODUCTION Le stress est défini comme laction dun facteur de lenvironnement (ou la combinaison de plusieurs dentre eux) limitant la réalisation des potentialités génétiquement déterminées de croissance, de développement et de reproduction chez les plantes (Levitt, 1980). Les problèmes causés par le stress salin sont fréquents à travers le monde et en particulier en zones méditerranéennes. Le Maroc, dont le climat est aride et semi- aride, est menacé par la salinisation. Ce problème saccentue avec lextension des superficies irriguées (Ftouhi, 1981). Chez le blé, les dégâts produits par le stress salin se manifestent communément par une séquence de changements morphologiques et physiologiques. Les techniques de culture in vitro des tissus végétaux ont pris une importance croissante dans le programme d'amélioration des plantes cultivées pour la sélection de lignées cellulaires tolérantes à la salinité (Dix, 1980; Kochba et al., 1982). Chez les céréales, les protocoles de sélection ont été appliqués à partir de différents explants (embryons matures ou immatures, anthères, suspensions cellulaires, ); ou sur des cals initiés à partir de ces explants (Li su et Heszki, 1986; Dekeyser et al., 1987; Zair et al., 1994). Chez le blé, les embryons immatures produisent des cals embryogènes de manière reproductible et à haute fréquence. Après transfert sur le milieu de régénération, ces cals ont des capacités élevées pour la formation de multiples plantules (Mathias et Simpson, 1986; He et al., 1986, 1988, 1990; Carman et al., 1987a, b). La pression sélective peut être appliquée pendant la phase de callogenèse et /ou de régénération. Quand la présence du sel n'interfère pas avec le processus de régénération lui même, comme dans le cas de l'embryogenèse (Rangan et Vasil, 1983; Chandler et Vasil, 1984), la présence de l'agent de sélection dans le milieu de régénération peut augmenter la probabilité de régénérer des plantes tolérantes (Nabors et al., 1980). En général, le stress peut s'appliquer lors de l'initiation des cals, à partir d'embryons mûrs ou immatures, ou sur des cals d'un certain âge obtenus en conditions non sélectives. Les cals continuant à proliférer en présence de l'agent sélectif sont considérés comme tolérants au stress. La pression de sélection s'exerçant sur les cals est généralement de longue durée, parce que toutes les cellules ne sont pas uniformément exposées à l'agent sélectif: les cellules qui ne sont pas en contact direct avec l'agent stressant peuvent échapper à la pression sélective, ce qui peur entraîner la régénération de plantes sensibles ou chimériques. Ce qui explique pourquoi la plupart des travaux de sélection in vitro utilisent la sélection de longue durée. Or, chez les cultures de cals de blé, les périodes de rétention de la capacité de régénération sont relativement courtes (Sears et al., 1981, Ahloowalia, 1982; Chen et al., 1985). Ainsi, au cours de notre étude, on sest intéressé à létude de lembryogenèse somatique et des capacités de régénération chez les cals de blé initiés directement sur le milieu de culture contenant différentes concentrations en NaCl dans le but de sélectionner de nouveaux cultivars mieux adaptés à la salinité. MATERIEL ET METHODES Matériel végétal. Nous avons utilisé deux variétés de blé dur (Karim et Sebou) et deux variétés de blé tendre (Sais et Merchouch). Les graines sont fournies par lInstitut National de Recherche Agronomique de Meknès (Maroc). Les plantes mères ont été cultivées au champ, sous des conditions naturelles. Les épis ont été prélevés 14 à 20 jours après lanthèse. A ce stade, les embryons immatures ont une longueur de 1,5 à 2 mm et montrent une bonne morphogenèse in vitro (Bennici et al., 1988). La stérilisation a été effectuée par passage des embryons immatures dans un bain déthanol (95°) pendant 30 mn, suivi dun bain dhypochlorite de calcium (33 %) pendant 15 mn. Les embryons ont été ensuite rincés dans de leau distillée stérile pendant 5 mn. Milieux de culture. Pour la callogenèse, le milieu de base utilisé est celui de Murashige et Skoog (1962). Il se compose de macroéléments, de microéléments, de sels minéraux et de vitamines et a été additionné de 30 g l-1 de saccharose, de 2 mg l-1 de 2,4 D (acide 2,4-dichloro-phenoxyacétique) et de différentes concentrations en NaCl (0 2,5 5 10 15 et 20 g l-1). Ce milieu a été ensuite solidifié par 7 g /l dagar. Le pH a été ajusté à 5,8 avant lautoclavage. Les cals initiés sur MS + NaCl ont été transférés sur le milieu de régénération dépourvu de sel. La différenciation des embryons somatiques et leur développement en plantules se fait de la même manière pour tous les cals issus des différents traitements. Après 5 semaines sur le milieu de régénération, le nombre moyen de plantules par cal régénérant ainsi que le pourcentage de régénération ont été évalués pour les quatre cultivars. Conditions de culture. Les cultures dembryons immatures sont soumises à lobscurité continue à une température de 25 ± 2°C le jour et 18 ± 2°C la nuit dans une chambre de culture pour linduction de la callogenèse. Les cals sont ensuite transférés dans des bocaux de régénération soumis à une photopériode de 16 h déclairement. Evaluation des résultats. Après 5 semaines de culture, on procède à la détermination du:
La régénération est estimée après cinq semaines de culture sur le milieu de régénération par :
Analyses statistiques. Les résultats obtenus ont été soumis à lanalyse de la variance et à la comparaison des moyennes par le test LSD en utilisant le logiciel " SAS" (SAS, 1988). Une régression a été aussi appliquée sur les données afin de corréler certaines variables. RESULTATS Effet de NaCl sur la callogenèse Germination de lembryon zygotique. Le stress salin a affecté significativement (P< 0,0001) la germination des explants des divers cultivars (Fig. 1). Laugmentation du stress salin dans le milieu se traduit par une diminution progressive et significative de la germination zygotique à partir de 10 g l-1 (Tableau 2) et tend à disparaître à 20 g l-1. Induction de la callogenèse. Le taux de callogenèse est de 100 % pour le témoin et la concentration 2,5 g l-1 de NaCl chez toutes les variétés (Fig. 2). A 5 g l-1, plus de 80 % des explants sont callogènes aussi bien pour le blé dur que pour le blé tendre. A partir de 10 g l-1 de NaCl, le taux de callogenèse diminue mais reste quand même important sur le milieu contenant 15 g l-1. A 20 g l-1, on enregistre le pourcentage le plus faible de callogenèse comparé à celui du témoin. Les cals formés sont de petite taille et seules les variétés Sais et Merchouch forment des cals globuleux. L'action du sel s'est donc traduite par une diminution progressive et significative du taux de callogenèse (Tableau 2). Effet sur le taux de cals embryogènes. Daprès le graphique de la Figure 3, on constate que le taux de cals embryogènes le plus élevé a été obtenu avec le milieu témoin et celui contenant 2,5 g l-1 de NaCl. Par la suite, les compétences embryogènes des explants diminuent significativement avec laugmentation du sel dans le milieu de culture (Tableau 2). Cette baisse est plus accentuée chez le blé dur que chez le blé tendre. Les embryons cultivés dans MS + 15 g et MS + 20 g l-1 de NaCl, présentent le pourcentage le plus bas de cals embryogènes. Cependant, celui - ci reste relativement important. On note aussi dans ces milieux la présence dembryons somatiques de petite taille et dispersés dans une masse de cals non embryogènes. Etude de la régénération des cals initiés sur MS supplémenté de différentes concentrations de NaCl Taux de régénération. Les cals initiés sur MS, MS + 2,5 g l-1, MS + 5 g l-1 et MS + 10 g l-1 de NaCl et transférés sur le milieu de régénération sans sel, présentent de bons pourcentages de régénération (Fig. 4). On assiste aussi à la régénération de cals initiés sur MS + 20 g l-1 de NaCl où lon note les pourcentages les plus faibles comparés à ceux des témoins. Sous leffet du sel, les explants ont perdu une plus grande partie de leur pouvoir de régénération et de leurs capacités à former des plantules. Des plantes albinos ont aussi été régénérées à partir des cals initiés sur 15 et 20 g l-1 de NaCl. Nombre moyen de plantules par cal régénérant. Les observations effectuées lors de la période de régénération ont permis de constater que les nombres moyens de plantules par cal régénérant (NMPR) les plus faibles sont obtenus dans le cas de la régénération des cals initiés dans les fortes concentrations en NaCL (20 g l-1) pour toutes les variétés (Tableaux 1). Dautre part, 70 % des plantules régénérées dans ces milieux de culture sont albinos (Photo 1). Il est arrivé parfois que les cals ne produisaient que des racines (Photo 2) ou ne montrent aucune morphogenèse et finissent par se nécroser. Par ailleurs, dans les faibles concentrations (2,5 et 5 g l-1 de NaCl), les cals régénérant présentent des plantules qui ont induit rapidement des racines bien développées et sont facilement séparables les unes des autres. On peut donc conclure que dans ce dernier cas, la régénération a bien eu lieu via lembryogenèse somatique. DISCUSSION ET CONCLUSION Chez les céréales, des protocoles de sélection de génotypes tolérants à la salinité ont été réalisés en adoptant les techniques de culture in vitro (Dix, 1980; Kochba et al., 1982). Loutil remarquable que constituent ces techniques est dune signification particulière pour l amélioration des cultures de blé. Parmi ces nouvelles techniques lobtention dune embryogenèse somatique in vitro par culture dembryons matures ou immatures, danthères, de suspensions cellulaires ou dinflorescences (Li su et al., 1986; Dekeyser et Bouharmont, 1987). Cest surtout lembryon immature qui a retenu au maximum lintention des chercheurs (Sears et Deckard, 1982; Ozias-Akins et Vasil, 1983c; Maddock et al., 1983; He et al., 1986). La pression sélective du sel est dans la majorité des cas, appliqué demblée dans des conditions qui provoquent une inhibition marquée de la croissance du génotype sauvage (Jacobs, 1988). Laction de lagent stressant pendant la phase de callogenèse peut avoir lieu à différentes phases de croissance des cals, après leur initiation sur un milieu dépourvu de sel Hasegawa et al., 1980; Ben-Hayyim et Kochba, 1982); ou à la phase dinitiation des cals (Smith et McComb, 1981; Zair, 1996). La pression peut également être exercée graduellement, en palier, en augmentant la concentration de lagent stressant au cours des repiquages successifs des colonies survivantes Meredith, 1984). Cette pression sélective graduelle peut cependant favoriser des mécanismes dadaptation physiologiques (Mchughnen et al., 1984, 1987) qui ne manifestent plus leurs effets au niveau des plantes régénérées, ce qui nest pas souhaitable dans un programme de sélection. Dans notre étude, on sest intress à lapplication du stress salin à la phase dinitiation des cals. En effet, le sel a provoqué une réduction progressive et significative de lembryogenèse des explants. On a constaté aussi que les cals formés ont montré une meilleure résistance comparée à celle des cals initiés sur MS puis repiqués sur le milieu contenant le sel. Ceci pourrait sexpliquer par le fait que lapplication du sel en phase dinitiation des cals pourrait provoquer des mutations qui conduiraient à la formation de lignées cellulaires tolérant mieux le chlorure de sodium. Ces résultats confirment ceux dAbrigo et al., 1985) qui ont montré que la résistance de la plante au sel se trouve principalement au niveau cellulaire. Eventuellement, cette approche pourrait entraîner un certains nombres de caractères non désirés ou même défavorables. le choix du moment dapplication du stress salin aux différentes variétés est important pour lacquisition de la tolérance Bodson et al., 1986; Oudija et al., 2001). Dautres part, les travaux de certains chercheurs Rahman et Kauls, 1989; Zair et al., 1996) ont montré que laddition de lacide ascorbique aux milieux de culture contenant de fortes concentrations en NaCl était nécessaire à linitiation dun cal embryogène. Par contre Smith et McComb 1981), en initiant des cals directement en présence de sel, ont montré que linitiation ainsi que la croissance des cals variaient avec le niveau de NaCl dans le milieu de culture. Ce qui confirme les résultats obtenus dans notre étude. Leffet de la salinité sest répercuté aussi sur le taux de régénération même si le milieu de culture ne contenait pas de sel. Ceci montre que la tolérance différentielle des plantes à la salinité est sous contrôle génétique (Epstein et al., 1980). Les bases de ce processus ne sont pas très claires. Les résultats obtenus par Gorham (1987), ont montré leffet majeur dun ou plusieurs gènes (localisé sur le long bras du chromosome 4D), sur la capacité du blé à discriminer entre le sodium et le potassium pour labsorption et le transport vers les parties aériennes. On peut donc conclure quen conditions de stress salin, on assiste à une réduction de lembryogenèse somatique et des capacités de régénération. Ces compétences dépendent à la fois du génotype et de la concentration en NaCl dans le milieu de culture et ne diminuent significativement qu à partir de 2,5 g l-1 chez toutes les variétés étudiées. Lapplication du stress pendant la phase d initiation des cals permet la régénération de plantules de meilleures performances. REMERCIEMENTS Nous tenons à remercier monsieur Mohammed Diouri, Professeur à la Faculté des Sciences de Meknès pour son aide dans la réalisation des analyses statistiques et pour la lecture critique de ce manuscrit. REFERENCES
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