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Archivos Latinoamericanos de Produccion Animal, Vol. 12, No. 1, 2004, pp. 8-11 Identificação das proteínas musculares de suínos submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida com Sodium Dodecil Sulfato (SDS). Identification of the muscular proteins of pigs submitted to the eletroforesis in polyacrilamide gel with Sodium Dodecyl Sulfate (SDS). S. M. Dierckx 1, P. R. Rodrigues-Ramos 2, J. Bortolozzi3 1 Professora Asssitente Doutor - Departamento de Produção
e Exploração Animal - FMVZ - UNESP - Botucatu Caixa Recibido Enero 13, 2002. Code Number: la04002 ABSTRACT Fragments of two pigs muscles of Landrace, Large White, Duroc purebred and crossbred, the eletroforesis was submitted in polyacrilamide gel with SDS, being objectified to verify there would be a specific pattern for pigs and to identify through the molecular weights, the main proteins. The results show that there would be a specific pattern for swine and they were identified miosina heavy chain, actina, troponina, tropomiosina and a light chain of miosina. Key words: SDS-PAGE, miosina, actina, troponina, tropomiosina, muscles, pigs RESUMO Fragmentos de dois músculos de suínos Landrace, Large White, Duroc e mestiços, foram submetidos a eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS , objetivando verificar se haveria um padrão específico para suínos e identificar através dos pesos moleculares, as principais proteínas. Os resultados mostraram que haveria um padrão específico para suínos e permitiram que fossem identificadas as cadeia pesadas e uma das leve de miosina, actina, troponina e a tropomiosina. Palavras chave: SDS-PAGE, miosina, actina, troponina, tropomiosina, músculos, suínos Introdução Os músculos são formados por duas proteínas principais: a miosina e a actina. Nos músculos esqueléticos, cardíaco e liso, a miosina forma os filamentos espessos, enquanto que a actina forma os delgados dos sarcômeros, as unidades repetitivas básicas contráteis das fibrilas musculares. Os dois tipos de filamento estão entrelaçados e dispostos paralelamente um ao outro. A contração muscular é de responsabilidade da interação da actina com a miosina e com os componentes adicionais: ATP (produção de energia), Ca2+, tropomiosina e a troponina. A miosina tem peso molecular de 470 KD, contendo 6 cadeias polipeptídicas: 2 pesadas com peso molecular de 200 KD e 4 leves cujos pesos moleculares variam de 15 a 27 KD. A actina, possui peso molecular de 43 KD e além de seu papel estrutural, ativa o ATP da miosina, desempenhando por isso importante papel na contração muscular. A terceira proteína é a troponina, apresenta PM de 66 KD, interage com a actina e a troponina, auxiliando na regulação da interação entre actina e miosina que ocorre durante a contração. A troponina tem peso molecular de 37 KD. Contém 3 subunidades diferentes: a TnT (37 KD) que se liga a tropomiosina; a TnI (20 KD) que inibe a interação entre a miosina e a actina e a TnC (18KD) reguladora das interações entre TnT e TnI, e outros componentes do sistema contrátil (Smith et al., 1988) Pette e Schnez (1977), analisando músculos Psoas e soleus de coelhos submetidos às técnicas de NADH-TR, SDH e mATPase pré incubada, em pH ácido e alcalino, para a diferenciação dos tipos de fibras, e submetendo também as amostras de proteínas miofibrilares, a eletroforese com SDS, em gel de disco, chegaram aos seguintes resultados: As fibras de contração lenta apresentaram uma cadeia de miosina leve específica para a contração lenta, enquanto as fibras de contração rápida vermelhas ou brancas apresentaram igual padrão eletroforético para as cadeias de miosina leve. Young e Davey (1981) estudando 3 diferentes músculos bovinos, o masseter (M), o reto abdominal (RA) e esternomandibular (SM), observou que o primeiro possui predominantemente fibras de contração lenta; o segundo, fibras de contração rápida e o terceiro uma mistura entre ambas. Jarsa et al. (1990) estudaram o polimorfismo e a identificação histoquímica em músculos de peixes de 2 espécies diferentes; usando as técnicas de SDH e mATPase para a padronização histoenzimológica e eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS (SDS-PAGE), e encontraram o padrão das cadeias leves da miosina, tropomiosina, troponina e proteínas C e M, específicas para os tipos de fibras do músculo. Sarmah (1994) com o objetivo de estudar o padrão eletroforético e os pesos moleculares da miosina e suas sub-unidades, pela técnicas de eletroforese em gel de poliacrilamida, coletou amostras do músculo biceps femural de bubalinos. Obteve, como resultado, a ocorrência de uma cadeia pesada com peso molecular de 200 KD e três leves, LC1 25 KD, LC2 17 KD e LC3 14 KD, semelhantes às três cadeias leves da miosina do coelho. O objetivos deste trabalho foi determinar e identificar dos possíveis padrões polimórficos das proteínas musculares, utilizando a técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS. Material e Métodos Foram usados 20 suínos (Suis scrofa domesticus), com peso ao redor de 90 kg, sendo 5 Landrace, 5 Large White, 5 Duroc e 5 mestiços, de ambos os sexos, abatidos em frigorífico da região de Botucatu - SP. As amostras com 0,5cm de comprimento por 0,5cm de largura. eram de 2 músculos, o m. Obturatori externi (músculo Obturador externo) e o m. Longus colli (músculo Longo do pescoço), conforme Figuras 1 e 2. Elas foram colocadas em nitrogênio líqüido, permanecendo até o momento das análises. O processo de maceração seguiu Lemos e Moraes (1992). O teor de proteína foi determinado pela técnica do biureto, sendo aplicado em cada poço o equivalente a 50 mg de proteína. A eletroforese em gel de poliacrilamida a 12,5%, com SDS usada foi a descrita por Hames e Rickwood (1990). A corrida eletroforética, foi realizada a 4 °C, e a voltagem foi inicialmente mantida em 100 V, até que o indicador passasse para o gel de separação, quando ocorreu a alteração para 150 V, sendo considerada encerrada logo após o indicador sair do gel. A coloração do gel foi feita fazendo-se a imersão na solução fixadora por 20 minutos. Em seguida na solução descorante por 2 minutos, na solução Corante Azul de Comassie a 60 ° C, por dez minutos. Transcorrido o tempo de coloração, a placa foi deixada na solução descorante de Comassie, até evidenciação das bandas. A seguir ela foi deixada por várias horas na solução preservante para que fosse hidratada. Para a análise das placas empregou-se o kit marca SIGMA MW - SDS 200, contendo marcadores com os seguintes pesos moleculares: miosina @ 205KD; b galactose @ 116 KD; fosforilase b @ 97,40 KD; albumina bovina @ 66 KD; albumina de ovo @ 45 KD;e anidrase carbônica @ 29 KD. O modelo estatístico adotado foi o seguinte: Yijk = m + GGi + M: GGij + e ijk Onde: m= média GG i= efeito do iésimo grupo genético M: GG ij = efeito do jésimo músculo dentro de grupo genético e ijk = erro residual Resultados e Discussão As proteínas dos músculos, para a maioria das amostras apresentou um padrão com 24, bandas (Figuras 3 e 4). A análise de variância não mostrou efeito de grupo genético e nem de músculo dentro de grupo genético, como pode ser observado na figura 3, onde se observa que todos os poços apresentam as mesmas bandas, independentemente do músculo e do grupo genético. Para melhor discussão e interpretação dos resultados obtidos, o gel foi dividido em regiões, referenciando os marcadores moleculares. A região 1, situada entre o ponto de aplicação na parte superior do gel e o marcador de maior peso molecular, a miosina (205 KD). Nesta região notou-se a presença de 1 banda., com PM de 251,44 KD. A região 2, localizada entre os marcadores miosina e b galactose (116 KD), possibilitou verificar 2 bandas, com PM de 192,03 e 165,12 correspondentes às cadeias pesadas de miosina, com molecular molecular ao redor de 200 KD (Jaenicke et al., 1994). A região 3, limitada, superiormente pela b galactose e inferiormente pela fosforilase b (97,4 KD), apresentou uma banda de fraca intensidade de coloração, com peso molecular de 100,79 que poderia corresponder à a actinina que, segundo Boles et al. (1992) teria peso molecular aproximado de 100 KD. A região 4, limitada pelos marcadores fosforilase b e albumina bovina (66 KD) apresentou 6 bandas correspondentes às proteínas com os seguintes pesos moleculares: 93,28; 89,00; 85,07; 82,94; 77,80 e 67,13 KD. A última, corresponde à tropomiosina. A região 5, situada entre a albumina bovina (66 KD) e albumina de ovo (45 KD), mostrou 6 bandas fracas. Elas são, respectivamente: 64,39; 58,81; 56,68; 51,19; 50,07; 49,27 e 47,73 KD. A região 6, situada entre os marcadores albumina do ovo e a anidrase carbônica (29 KD), apresentou 6 bandas 41,13; 36,65; 33,54; 31,01 e 30,37 KD, que corresponderiam a actina com PM de aproximadmente 45 KD, a troponina com 37,74 KD e concordantemente com Boles et al. (1994), que também detectou uma banda com peso molecular ao redor de 41 KD. A última região não permitiu identificar as proteínas restantes, pois elas se situaram abaixo do marcador molecular de menor peso, tendo sido obervadas 8 bandas. Embora não seja possível a confirmação, tendo-se em vista a falta de marcadores de mais baixo peso molecular, possivelmente nesta última região do gel poderíamos encontrar as bandas correspondentes às cadeias leves de miosina com peso molecular variando de 15 a 27 KD e também, as subunidades da troponina a TnI (20KD) e a TnC (18KD). A eletroforese das proteínas nativas em gel de poliacrilamida a 12,5% com SDS não mostrou diferenças no padrão eletroforético para grupos genéticos e músculos. Isto pode ser explicado talvez, pelo fato de que quando as proteínas são tratadas com SDS, a migração ocorre por diferença de peso molecular entre as proteínas. Indicado neste trabalho, que não houve diferença entre elas, assim, as proteínas são as mesmas e permaneceram preservadas, permitindo que fossem identificadas . Conclusões 1. Há realmente um padrão eletroforético específico para suínos, que não foi alterado pelo efeito de músculo ou grupo genético 2. A técnica usada permitiu a identificação das cadeias pesadas e de uma das leve de miosina, da actina, troponina e tropomiosina, além da presença de várias bandas com baixo peso molecular. Literatura Citada
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