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Archivos Latinoamericanos de Produccion Animal, Vol. 12, No. 1, 2004, pp. 21-27 Efeito da sustituição do farelho de soja pela levedura (Saccharomyces cerevisiae) como fonte protéica em dietas para leitões desmamados sobre a morfologia intestinal e atividade das enzimas digestivas intestinais Effect of the substitution of soybean meal by dehydrated yeast (Saccharomyces cerevisiae) as a protein source in diets for weanling piglets on the intestinal digestive enzymes W. Castillo1, R. N. Kronka, J. M. Pizauro Jr., M. C. Thomaz, L. E. Carvalho2. 1Bolsista da Fundação de Amparo à Pesquisa
do Estado de São Paulo -FAPESP. Facultad de Zootecnia, Universidad Nacional Recibido Septiembre 2, 2002. Code Number: la04004 ABSTRACT The effect of substitution of soybean meal by spray-dry dehydrated yeast (SDDY) on the morphology of the small intestine mucosa and activity of several intestinal digestive enzymes was evaluated. Sixty 21-day old weaned piglets were distributed according to a randomized blocks design with a 5 x 4 factorial arrangement (5 dietary substitution levels: 0, 25, 50, 75, and 100% x 4 time periods: 0, 4, 8, and 12 d after weaning). Increasing SDDY substitution level caused a reduction of the intestinal villi size in the first one-quarter segment of the small intestine, and a linear increase in the activity of sucrase and maltase, whereas activity of dipeptidases showed a quadratic response. Key Words: Crypts, intestinal enzymes, early weaned pigs, Saccharomyces cerevisiae, villi. RESUMO O objetivo do trabalho foi avaliar o efeito produzido pela substituição do farelo de soja (FS) pela levedura desidratada em «spray dry» (LDSD) como fonte protéica sobre a estrutura do intestino delgado, e na atividade das enzimas digestivas intestinais. Foram utilizados 60 leitões desmamados aos 21 dias de idade, alojados individualmente e distribuídos num delineamento de blocos ao acaso com arranjo fatorial 5x4 (5 níveis de substituição: 0, 25, 50, 75 e 100% x 4 épocas de abate: 0, 4, 8 e 12 dias após o desmame). A LDSD no alimento causou diminuição na altura das vilosidades no primeiro quarto do intestino delgado e promoveu aumento na atividade da sacarase e maltase linearmente, entanto que, as dipeptidases mostraram resposta quadrática. Palavras Chave: Criptas, Enzimas intestinais, Leitões, Saccharomyces cerevisiae, Vilosidades. Introdução As proteínas antigênicas contidas na soja (glicinina e b-conglicinina), podem ser as responsáveis por respostas transitórias de hipersensibilização observadas em leitões, ocasionando atrofia das vilosidades, aumento da mitose das células da cripta, diarréia (Dunsford et al., 1989) e redução na atividade digestiva das enzimas (Kelly et al., 1991b), o que afeta o desenvolvimento dos leitões desmamados. Quando tem-se realizado um insuficiente processamento no farelo de soja(FS), para eliminar os fatores antinutricionais pode-se encontrar proteínas antigênicas no íleo de leitões que recebem FS no alimento (Li et al., 1991), demostrando também, que estes fatores resistem à hidrólise pelas enzimas proteolíticas, as mesmas que podem ter a sua atividade comprometida em função da presença de inibidores de proteases e lectinas contidos na soja ou FS quando mal processados (Armour et al., 1998). Em função destes fatores antinutricionais presentes no FS e os efeitos sobre a mucosa intestinal e atividade das enzimas digestivas, estuda-se a levedura, subproduto da obtenção do álcool a partir da cana de açúcar e desidratada por «spray dry» (LDSD), com conteúdo de proteína bruta (PB) de 40%, como alternativa que poderia substituir ao FS na alimentação de suínos e sem causar alterações digestivas em leitões recém desmamados. Para verificar isto, foi necessário avaliar os efeitos de substituição da proteína do FS pela proteína da LDSD sobre a morfologia do intestino delgado e a atividade das enzimas digestivas intestinais (sacarase, maltase e dipeptidases). Material e Métodos O experimento foi conduzido no setor de suinocultura da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias - UNESP, Jaboticabal - SP, Brasil. Foram utilizados 60 leitões híbridos comerciais, desmamados aos 21 dias de idade, com peso médio de 5.90 + 0.75 kg. Após o desmame foram abatidos 15 leitões, sendo os outros alojados em baias individuais onde receberam as mesmas condições de manejo, dieta e água a vontade até o abate com 4, 8 e 12 dias pós-desmame, sendo que em cada época foram abatidos 15 animais (Castillo et al., 2004). Os tratamentos foram o resultado da combinação dos fatores: Níveis de substituição da PB do FS pela PB da LDSD na dieta (0, 25, 50, 75 e 100%) e, épocas de abate dos leitões (0, 4, 8 e 12 dias após o desmame). As dietas foram isoprotéicas e isocalóricas e formuladas para conter 18% de PB e 3265 kcal de EM/kg, atendendo as exigências nutricionais de aminoácidos, minerais e vitaminas dos leitões na fase inicial, seguindo as normas do NRC (1988). Foram avaliados em cada período de abate, a atividade das enzimas digestivas sacarase, maltase e dipeptidases (expresso em unidades de atividade enzimática - UA), a estrutura da mucosa intestinal, em termos de altura das vilosidades (AV), profundidade das criptas (PC) e relação vilosidade:cripta (AV:PC). Os animais foram deixados em jejum de 15 a 16 h, depois do abate, no intestino delgado (ID) foram localizadas as porções 25 e 50% do comprimento total e coletadas amostras de 20 cm, congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a - 70 ºC. Também foram coletadas amostras de 1 cm nas porções 25 e 50% do comprimento e conservadas para análise histológica. As atividades da sacarase, maltase e dipeptidase foram avaliadas na mucosa de cada porção coletada do ID. Sacarase e maltase foram determinadas através da dosagem da glicose liberada na hidrólise dos substratos sacarose e maltose respectivamente, pelas enzimas presentes no extrato de mucosa, seguindo a metodologia padronizada a partir de Dahlqvist (1964) e Kidder e Manners (1980). A atividade da dipeptidase foi determinada usando como substrato o dipeptídeo L-leucilglicina (Leu-Gli) segundo Nicholson e Kim (1975). Para a análise histológica, foram confeccionadas lâminas contendo cortes longitudinais, semi-seriados de 5 mm de espessura e corados segundo a técnica da hematoxilina de Harris-eosina. As medições foram feitas através de microscopia de luz, com aumento de 230 vezes, usando um sistema analisador de imagem da Kontron Elektronik (Video Plan). Foi utilizado o delineamento em blocos casualizados, em esquema fatorial 5 x 4 (5 dietas x 4 épocas de abate), com 3 blocos, sendo o peso dos animais ao desmame o fator de bloqueio e tendo um animal como parcela. Os dados foram submetidos à análise de variância, aqueles que não mostraram interação significativa foram analisados como fatores principais, através da análise de variância da regressão, utilizando o programa ESTAT (Sistema de Análise Estatística - UNESP/FCAVJ). No caso das interações, foram desdobradas e as médias dos tratamentos comparadas pelo teste de Tukey (Steel e Torrie, 1985). Resultados e Discussão Estrutura da mucosa intestinal O efeito da inclusão da levedura na díeta e dos periodos após a desmama sobre a estrutura da mucosa intestinal é monstrada na Tabela 1. Foi encontrado interação significativa entre os níveis de levedura e os períodos para altura das vilosidades na porção 25% do ID,ver Tabela 2. Desdobrando a interação para AV na porção 25% do ID (Tabela 2) verificou-se que os animais que receberam níveis de 0, 50 e 100% da substituição da proteína do FS pela proteína da LDSD mostraram menor (P<0.05) AV aos 4 dias após o desmame quando comparado com àqueles dos 12 dias. Dentro dos períodos, os níveis de levedura não mostraram influência sobre a AV nos animais avaliados aos 4 e 8 dias após o desmame. Aos 12 dias, os animais que não receberam levedura mostraram maiores AV (P<0.05) que aqueles que receberam 75% de levedura. Embora a literatura mostre grande variabilidade na medição da AV e PC, os resultados foram semelhantes aos obtidos por Makkink et al. (1994), Nuñez et al. (1996) e Lopes (1999). A redução na AV e aumento na PC dos leitões tem sido amplamente relacionado com o desmame (Hampson, 1986; Dunsford et al., 1989; Pluske et al., 1997). Alguns autores têm atribuído ao baixo consumo de alimento e à hipersensibilidade causada pela soja como as possíveis causas da diminuição da AV (Li et al., 1991; Kelly et al., 1991b; McCracken et al., 1995; Thomaz, 1996). Outros estabeleceram uma estreita relação entre consumo de matéria seca e altura das vilosidades de leitões alimentados com leite de vaca e substitutos do leite (Nuñez et al., 1996; Pluske et al., 1996b; Zijlstra et al., 1996). No entanto, a quantidade de energia consumida, independente do tipo de alimento parece ser a responsável pelas mudanças na estrutura intestinal (Pluske et al., 1996c). Tabela 1. Altura das vilosidades (AV), profundidade das criptas (PC) e relação AV:PC da mucosa do intestino delgado de leitões avaliado nos segmentos (SI) 25 e 50% do comprimento total, segundo o nível de substituição e o período após desmame.
1 Houve interação significativa
entre os fatores. O efeito da hipersensibilidade causado pelo farelo de soja poderia ser controlado pela substituição total do farelo de soja pela LDSD. Todavia, neste mesmo experimento, quando foi medido o consumo diário de ração (CDR) e peso de órgãos, os animais que apresentaram maior CDR (com 41.18% de substituição da PB do FS pela PB da LDSD) não mostraram maior AV, embora tenham apresentado o intestino delgado mais pesado, o que está de acordo com Zijlstra et al. (1996). Os resultados estão de acordo também, com os obtidos por Pita (1997) que não encontrou variação na AV, PC e relação AV:PC de leitões que receberam LDSD até 15% na dieta por 23 dias após o desmame. Tabela 2. Desdobramento dos tratamentos para altura das vilosidades (mm) da mucosa no segmento de 25% do intestino dos leitões, segundo o período após desmame1.
1Médias seguidas de letra minúscula
(maiúscula) diferente em cada coluna (linha) diferem entre si pelo teste
de Tukey (P<0.05). Os resultados podem estar relacionados com o consumo de alimento. Nos 8 primeiros dias o CDR foi baixo para provocar uma resposta significativa na AV. No desdobramento da interação da AV na porção 25%, aos 12 dias foi notado uma variação entre tratamentos (Tabela 2). A grande variabilidade no CDR e a complexidade na morfologia intestinal para determinar a AV podem afetar o efeito dos tratamentos. Os níveis de levedura não influenciaram a PC e a relação AV:PC, porém, entre períodos mesmo não tendo ocorrido variação na PC, as menores relações AV:PC obtidas aos 4 e 8 dias após o desmame e comparado com as obtidas no dia do desmame e aos 12 dias após, foram indicativos de alterações tanto a nível de AV como de PC causados pelo desmame. Estes resultados sugerem que ocorreu um aumento na perda de células ocasionando vilosidades mais curtas, e incrementando a proliferação celular com aumento na PC (Hampson, 1986) ou um decréscimo na taxa de renovação celular, como resultado de uma reduzida divisão celular nas criptas, reduzindo a relação AV:PC (Pluske et al.,1997). A presença de bactérias entero-patogênicas e sua interação com o intestino, a má adaptação dos leitões aos agentes estressores do desmame, a supressão total do leite da mãe, a mudança da dieta após o desmame e as citoquinas como reguladoras do crescimento intestinal foram relatados por Pluske et al. (1997) como os fatores que contribuem nas mudanças da estrutura intestinal por ocasião do desmame. Atividade das Enzimas Intestinais O conteúdo de proteína da mucosa intestinal não foi afetado pelos níveis de levedura na dieta ou pelos dias após o desmame (Tabela 3). Segundo a tabela, na porção 25% a atividade da sacarase foi linear tanto para os níveis de levedura e quadratica para os períodos. Na porção 50% houve interação (resultados desdobrados na Tabela 4). A atividade da maltase, aumentou linearmente com os níveis de levedura, em ambos segmentos avaliados. Entre períodos, a atividade da maltase não foi afetada pelos dias após o desmame (Tabela 3). A atividade da dipeptidase (substrato L-leucilglicina), determinada na porção de 25% do ID, não mostrou efeito significativo. Todavia, a atividade determinada na porção 50% do ID mostrou efeito quadrático em função dos níveis de levedura. A avaliação entre períodos mostrou efeito quadrático apenas para a atividade determinada na porção 25%. Na interação entre níveis de levedura e períodos avaliados para a atividade da sacarase determinada na porção 50% (Tabela 4) observou-se que nos níveis 0 e 25% de substituição da PB do FS pela PB da LDSD a atividade não mostrou variação significativa (P>0.05) entre os períodos. Nos níveis 50 e 75% de substituição a atividade mostrou-se menor aos 4 dias após o desmame quando comparado com a obtida aos 8 e 12 dias. Dentro dos períodos, aos 4 e 8 dias, os níveis de inclusão da levedura não influenciaram a atividade da sacarase, porém, aos 12 dias os níveis de 75 e 100% de substituição apresentaram maior atividade da sacarase em relação ao nível de 0% de levedura. O conteúdo de proteína da mucosa dos leitões abatidos ao desmame ou nos períodos posteriores (Tabela 3), apresentaram valores próximos aos determinados por Kelly et al. (1991a,b) e por Pluske et al. (1996a,b) em leitões desmamados dos 14 aos 28 dias e avaliados 5 a 7 dias depois, recebendo dieta sólida ou leite fresco de vaca. Entre períodos, mesmo quando não foi encontrada variação significativa, o conteúdo de proteína aos 8 dias após o desmame foi 16 a 17% menor que o obtido ao desmame. Kelly et al. (1991a) também encontraram maior conteúdo de proteína na mucosa de leitões desmamados aos 14 dias em relação àqueles avaliados 3, 5 e 7 dias após, períodos em que receberam suplementação continua de dieta sólida. Este menor conteúdo protéico na mucosa estaria em função da quantidade de energia que os leitões ingeriram após o desmame, independente do tipo de dieta (Pluske et al., 1996c). Os valores de atividade da sacarase determinados neste experimento e expressos em UA/g de proteína, foram semelhantes aos descritos por Kelly et al. (1991a,b) e Pluske et al. (1996b,c) e superiores aos obtidos por Collington et al. (1990) quando calculados e expressos em UA/g de mucosa. Os valores de atividade da maltase foram superiores aos obtidos por Kelly et al. (1991a,b) e inferiores aos obtidos por Nuñez et al. (1996) quando expresso em UA/g de proteína. A atividade da dipeptidase, quando expressa em UA/g de mucosa, foi aproximadamente 50% inferior que a atividade determinada por Collington et al. (1990). Estas variações nos resultados podem ter sido influenciados por fatores como metodologia, formas de expressão da atividade enzimática, idade dos animais ao desmame, alimento consumido pelos leitões antes do desmame, a condição corporal e o estado de saúde do animal, podem ter influenciado os resultados (Pluske et al., 1997). Tabela 3. Atividade enzimática da sacarase, maltase e dipeptidase, avaliadas na mucosa do intestino delgado de leitões, nos segmentos (SI) 25 e 50% do comprimento total, segundo o nível de substituição e o período após desmame.
w Unidades de atividade enzimática (UA):
Sacarase /o Maltase (1 mmol de sacarose /o maltose
hidrolisado/min). Dipeptidase (1 mmol de leucilglicina hidrolisado/min) As pesquisas realizadas tem procurado associar a redução na altura das vilosidades e incremento na profundidade das criptas após o desmame com a redução na atividade específica das enzimas presentes na «borda em escova» dos enterócitos, nos dias seguintes ao desmame, acreditando-se que um aumento na taxa de proliferação celular nas criptas e na migração dos enterócitos às vilosidades aumentaria o número de enterócitos imaturos com pouca atividade digestiva e absortiva (Smith, 1984; Hampson, 1986; Hampson e Kidder, 1986; Pluske et al., 1996b). No entanto, a grande variabilidade nos experimentos nem sempre têm resultado em diferenças significativas nas atividades das enzimas. Tabela 4. Desdobramento dos tratamentos para a atividade da sacarase (UA/g proteína)w no segmento de 50% do intestino de leitões abatidos após o desmame, segundo o período após desmame1.
w Unidades de atividade enzimática (UA) da Sacarase
(1
mmol de sacarose hidrolisado/min). Na distribuição das enzimas, quando avaliadas em diferentes segmentos do comprimento do intestino delgado, tem-se encontrado maior atividade e uniformidade nas porções de 15 até 60% do comprimento para sacarase e maltase (Manners e Stevens, 1972; Kidder e Manners, 1980; Kelly et al., 1991a) e para dipeptidases (Collington, 1990) em leitões com 3 a 4 semanas de idade. As determinações nas porções 25 e 50% do comprimento, mostraram diferenças estatísticas, quando os animais foram submetidos ao efeito da substituição da PB do FS pela PB da LDSD e quando avaliados em diferentes períodos após o desmame. Para a sacarase, enquanto a atividade avaliada na porção 25% do ID aumentou linearmente com o aumento da levedura na dieta; na porção 50% a interação entre níveis de levedura e períodos revelou que esse aumento só foi significativo quando avaliado aos 12 dias após o desmame e com níveis de 75 e 100% de substituição. Embora não tenha sido encontrada uma relação estreita com a AV, pois a interação na AV ocorreu na porção 25% do ID, foi constatado também que as avaliações feitas aos 12 dias de idade mostraram variação na AV em função dos níveis de levedura. Estes fatos sugerem que provavelmente o maior tempo após o desmame associado com o maior consumo de dieta nesse período seriam os responsáveis pelas mudanças na morfologia e fisiologia intestinal dos leitões. Kelly et al. (1991b) observaram maior atividade da sacarase e maltase quando expressas em moles/dia em animais que consumiram maior quantidade de dieta após o desmame. Pluske et al. (1996c) encontraram maior atividade da sacarase (em UA/g de proteína) em leitões que receberam dieta de inicio farelada quando comparados àqueles alimentados com leite fresco de vaca, recebendo em ambos os casos igual quantidade de energia. Concluindo em ambos os casos que, os componentes da dieta induziram à resposta das enzimas. Para a maltase, o crescimento linear ou quadrático da atividade respectivamente em ambas as porções avaliadas em função dos níveis crescentes de levedura pode indicar a adaptação e resposta desta enzima ao substrato. A resposta encontrada entre períodos avaliados discordaram dos resultados obtidos por Kelly et al. (1991a) que encontraram aumento da atividade da maltase 3 dias após os leitões serem desmamados com 14 dias de idade; porém, leitões desmamados os 21 dias de idade mostraram maior atividade da maltase em relação àqueles desmamados aos 14 dias. Neste experimento os leitões foram desmamados aos 21 dias e o consumo de dieta antes do desmame pode ter elevado a atividade da maltase, provocando diminuição, embora não significativa, nos dias seguintes ao desmame. Quanto a dipeptidase, os resultados estão de acordo com Collington et al. (1990) que encontraram maior atividade na porção 50% do ID em relação às porções anteriores. A maior atividade da dipeptidase foi obtida com 54% de substituição da PB do FS pela PB da LDSD (Castillo et al., 2004), o que pode ser em resposta ao CDR em função dos níveis de levedura na dieta. Estas suposições são reforçadas com as menores atividades obtidas aos 4 dias após o desmame, ocasião em que os leitões tiveram menor CDR. Estes resultados concordaram com aqueles reportados por Collington et al. (1990) que encontraram maiores atividades da dipeptidase em leitões antes do desmame. Conclusões A inclusão da LDSD no alimento, com excepção do nível de 75% de substituição e aos 12 dias após o desmame que causou diminuição na altura das vilosidades no primeiro quarto do intestino delgado, não teve influencia sobre a altura das vilosidades, profundidade das criptas e na relação vilosidades:criptas. A substituição de levedura de cana pelo farelo de soja como fonte protéica no alimento, promoveu aumento na atividade da sacarase e maltase linearmente, entanto que, as dipeptidases mostraram resposta quadrática com máxima atividade no nível de 54% de substituição. Literatura Citada
© 2004 ALPA. Arch. Latinoam. Prod. Anim. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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