Archivos Latinoamericanos de Produccion Animal Asociacion Latinoamericana de Produccion Animal ISSN: 1022-1301 EISSN: 2075-8359 Vol. 12, Num. 2, 2004, pp. 59-65

Archivos Latinoamericanos de Produccion Animal, Vol. 12, No. 2, Mayo-Agosto, 2004, pp. 59-65

Producción de proteína microbiana a partir de los desechos
del procesamiento de la caña de azúcar (bagacillo)¹

Microbial protein production from waste of sugar cane processing (bagasse pith)

J. R. Ferrer², Y. Davalillo, C. Chandler, G. Páez, Z. Mármol y E. Ramones

¹Proyecto No. CC-0869-01 financiado por el Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico (CONDES). LUZ.
²Apartado 4011-A 526. Maracaibo, Estado Zulia, Venezuela. E-mail: jrferrer@cantv.net

Laboratorio de Tecnología de Alimentos, Escuela de Ingeniería Química, Facultad de Ingeniería, La Universidad del Zulia, Venezuela.

Recibido Mayo 15, 2003.
Aceptado Febrero 05, 2004.

Code Number: la04008

ABSTRACT. A study was undertaken of microbial biomass production using hydrolyzed pith bagasse acid as a growth medium. Hydrolysis was carried out using diluted (6%v/v) sulfuric acid in a reaction time of four hours. The equipment used operated at boiling conditions with atmospheric pressure reflux, and with a liquid/solid relation of 30. The concentration of sugars in the hydrolyzed solution was carried out by a rotational evaporator. The Candida utilis (ATCC 9256) and Saccharomyces cerevisiae (ATCC 26603) yeasts were cultivated in the hydrolyzed concentrate at a pH of 5.00, 30 °C and 200 rpm. The greatest production of biomass was 4.90 ± 0,03 kg/m³ in S. cerevisiae and 9.45 ± 0,01 kg/m³ in C. utilis. The yield of biomass was 1.19 ± 0,012 kg/kg in S. cerevisiae and 1.86 ± 0,040 kg/kg in C. utilis. The specific rate of growth was 0.0141 ± 0,0001 and 0.0544 ± 0,0001 h^-1 for S. cerevisiae and C. utilis, respectively. The biotechnological process utilized is an important fundamental alternative for the industrial usage of pith bagasse from sugar cane through the production of a protein concentrate for animal feeds.

Key words: Microbial biomass, acid hydrolysis, Candida utilis, Saccharomyces cerevisiae.

RESUMEN. Se realizó un estudio de la producción de biomasa microbiana usando hidrolizado ácido de bagacillo de caña de azúcar como medio de crecimiento. La hidrólisis se llevó a cabo con ácido sulfúrico diluido (6%v/v) en un tiempo de reacción de 4 horas. El equipo utilizado se operó en condiciones de ebullición a reflujo a presión atmosférica, con una relación líquido/sólido de 30. La concentración de los azúcares del hidrolizado fue realizada en un evaporador rotatorio. Las levaduras Candida utilis (ATCC 9256) y Saccharomyces cerevisiae (ATCC 26603) fueron cultivadas en el hidrolizado concentrado a pH 5,00, 30 °C y 200 rpm. La mayor producción de biomasa fue de 4,90 ± 0,03 kg/m³ para S. cerevisiae y 9,45 ± 0,01 kg/m³ para C. utilis. El rendimiento de biomasa en función de consumo de sustrato fue 1,19 ± 0,012 kg/kg para S. cerevisiae y 1,86± 0,040 kg/kg para C. utilis. La tasa específica de crecimiento fue 0,0141 ± 0,0001 y 0.0544 ± 0,0001 h^-1, para S. cerevisiae y C. utilis, respectivamente. El proceso biotecnológico implementado, es una alternativa de importancia fundamental, para el aprovechamiento industrial del bagacillo de caña de azúcar como vía de producción de concentrado proteico para alimentación animal.

Palabras clave: Biomasa microbiana, hidrólisis ácida, Candida utilis, Saccharomyces cerevisiae.

INTRODUCCIÓN 

Los métodos convencionales para producir alimentos ricos en proteínas no son suficientes para cubrir la alta demanda de estos a nivel mundial. Por consiguiente, la exploración de fuentes no convencionales como la proteína microbiana representa una alternativa de importancia fundamental para complementar dietas en alimentación animal (Church y Pond, 1992).

La razón principal para orientar la investigación hacia estas fuentes proteicas, es que se logra una alta producción de masa microbiana por hora, debido a que su tiempo de duplicación es mayor al compararlo con otras fuentes animales o vegetales de proteína (Meyer et al., 1992; Nigan, 2000).

Los sustratos utilizados para la producción de proteína microbiana incluyen fuentes de carbono fósil (hidrocarburos líquidos y gaseosos) y las fuentes de carbono renovables como melaza, suero e hidrolizados de polisacáridos (Bui y Galzy, 1990; Leveau y Bouix, 2000).

La levadura utilizada para alimentación animal es un producto rico en proteínas y en vitaminas, la cual no fermenta por que presenta un metabolismo exclusivamente respiratorio sobre sustratos carbonados. Los valores promedios de proteínas, expresados en porcentajes de materia seca, para Candida utilis, Candida lipolytica, Candida rugosa, Schawaniomyces cerevisiae y Kluyveromyces marxianus varía entre 33 y 45 % (Bui y Galzy, 1990). Estas proteínas tienen en común un alto porcentaje de lisina (del 7 al 9 %) y un bajo porcentaje de aminoácidos azufrados (de 0,7 a 1,7 % de cisteína y de 1 a 2 % de metionina).

El bagacillo de caña de azúcar es un material lignocelulósico, obtenido de las centrales azucareras como desecho, representando el 25 % del total de la caña de azúcar procesada. La hidrólisis ácida del mismo con ácido sulfúrico diluido (6 % v/v) y 4 horas de reacción, produce 16,76 kg/m³ de azúcares reductores (Ferrer at al., 2002). Esta metodología ha permitido desarrollar procesos biotecnológicos para obtener proteína microbiana y compuestos químicos, usando como sustrato diferentes desechos agropecuarios (Colina et al., 1998; Quintero et al., 2001) y desechos de la industria de mariscos (Ferrer et al., 1996; García et al., 1996).

Estableciendo la alternativa tecnológica de aprovechamiento del bagacillo de caña de azúcar y considerando la posibilidad de producir un concentrado proteico para suplementar la alimentación de bovinos y caprinos, se estableció como objetivo de esta investigación, estudiar los parámetros de crecimiento de las levaduras Candida utilis (ATCC 9256) y Saccharomyces cerevisiae (ATCC 26603) en el hidrolizado concentrado de bagacillo de caña de azúcar.

MATERIALES Y MÉTODOS 

Microorganismos. Las cepas utilizadas en esta investigación fueron Candida utilis (ATCC 9256) y Saccharomyces cerevisiae (ATCC 26603), obtenidas de la American Type Culture Colletion (USA), en estado liofilizado. Ambos microorganismos fueron cultivados en cuñas con agar YMBacto a 4 °C y subcultivados cada tres meses. El medio de mantenimiento tiene la siguiente composición: Agar extracto de malta (3 kg/m³), glucosa (10 kg/m³), peptona (5 kg/m³) y agar (20 kg/m³) (American Type Culture Collection, 1991).

Sustrato. El bagacillo de caña de azúcar, objeto de este estudio, fue suministrado por la Central Azucarera Matilde, ubicada en Chivacoa, Estado Yaracuy, Venezuela.

El material secado (estufa Memmert 840 Schwabach, modelo 772534, Alemania) y molido (molino Thomas Wiley, modelo 4 laboratory mill, USA) fue cernido a través de un tamiz de 20 mesh, para homogeneizar las partículas a un tamaño menor o igual a 0,84 mm. El mismo fue mantenido a temperatura ambiente en bolsas plásticas cerradas herméticamente hasta el momento de su uso.

El bagacillo tamizado fue sometido a caracterización química mediante la determinación de: materia seca (934.01), proteína cruda (988.05), grasa (954.02), cenizas (942.05), lignina, celulosa y hemicelulosa (973.18), utilizando la metodología descrita en el manual de la AOAC (1990). Todos los análisis se realizaron por triplicado.

Hidrólisis ácida. El bagacillo de caña de azúcar fue sometido a un proceso de hidrólisis ácida mediante reflujo total a presión atmosférica, utilizando un equipo de destilación de vidrio, con una capacidad de operación de 500 mL. La concentración del ácido sulfúrico, la relación líquido/sólido y el tiempo de reacción usadas fueron 6% v/v, 30 y 4 horas, respectivamente. El hidrolizado se enfrió rápidamente, en un baño con hielo, para detener la reacción, se filtró al vacío a través de papel Whatman Nº 1 y posteriormente, se ajustó el pH de 2,00 a 4,50 con una solución 2N de NaOH. Finalmente, se decoloró con carbón activado y se guardó bajo refrigeración (8 °C) hasta su utilización (Ferrer et al., 2002).

Concentración del hidrolizado. El equipo utilizado para concentrar el hidrolizado fue un evaporador rotatorio con baño de calentamiento (90 °C) (Marca Heidolph, Alemania), el cual se conectó a una bomba de vacío (Marca Welch duo seal, modelo 1400, USA) y a un sistema refrigerante. Las condiciones de operación de la bomba de vacío y del refrigerante fueron 88 kPa de presión de vacío y 19 °C de temperatura, respectivamente.

Cultivo de S. cerevisiae en medio definido. Para conocer el comportamiento del crecimiento de la levadura S. cerevisiae utilizada en este estudio, se llevó a cabo un cultivo por carga por triplicado, en un medio definido con la siguiente composición(Ferrer et al., 1996): glucosa (225 kg/m³), peptona (10 kg/m³), KH₂PO₄ (0,25 kg/m³) y sulfato de magnesio (0,25 kg/m³).El bioproceso se realizó en fiolas de 500 mL con un volumen de trabajo de 100 mL con un pH ajustado a 4,5 y en una incubadora Innova 4300 (New Brunswick Scientific, USA ) a 30 °C y 200 rpm, por un período de tiempo de 22 horas. El inóculo consistió de 10 mL de suspensión de levadura, la cual tenía 72 horas de incubación a 30 °C (con 10⁶ a 10⁷ unidades formadoras de colonias).

Para el establecimiento de la cinética del bioproceso, se filtró el contenido de la fiola a través de un filtro de membrana milipore (poro de 0,2 ìm), recuperándose en viales para la determinación de azúcares reductores y de biomasa. La biomasa se determinó gravimétricamente, por triplicado, luego de secar la levadura a 45 °C hasta peso constante. El contenido de azúcares reductores se determinó utilizando el método del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) con glucosa como estándar (Ferrer et al., 2002).

Cultivo de S. cerevisiae en medio hidrolizado de bagacillo de caña de azúcar. La capacidad de desarrollo de la levadura S. cerevisiae en el hidrolizado obtenido a partir del bagacillo de caña de azúcar, se estableció mediante la cinética de producción de biomasa y el porcentaje de consumo de sustrato (representado por el porcentaje de la diferencia entre los azúcares reductores iniciales y los azúcares reductores presentes con el tiempo, con respecto a los azúcares reductores iniciales).

Para tal fin, se cultivó la levadura en hidrolizado con pH ajustado a 4,50 y suplementado con medio mineral estéril. Dicho medio se formuló con la siguiente composición: KH₂PO₄ (0,25 kg/m³), sulfato de magnesio (0,25 kg/m³) y peptona (10 kg/m³). El volumen de trabajo fue de 100 mL en fiolas de 500 mL. El medio de cultivo fue inoculado con 10 mL de una suspensión de levadura (10⁶ a 10⁷ unidades formadoras de colonias) acondicionadas en el hidrolizado suplementado. Las fiolas se incubaron a 30 °C y 200 rpm, durante 22 horas.

Cultivo de C. utilis en medio definido. La cepa de C. utilis se cultivó en un medio de crecimiento conocido (Nigan, 1999) para establecer la cinética de crecimiento y de consumo de sustrato. La composición del medio utilizado fue: glucosa (200 kg/m³), KH₂PO₄ (10 kg/m³), (NH₄)₂SO₄ (70 kg/m³), MgSO₄ (2,5 kg/m³), CaCl₂ (2 kg/m³) y extracto de levadura (0,1 kg/m³).

El cultivo se realizó en fiolas de 500 mL, por triplicado, con un volumen de 100 mL de medio de crecimiento e inoculado con 10 mL de suspensión de levadura (10⁶ a 10⁷ unidades formadoras de colonias). El crecimiento del cultivo a 30 °C y 200 r.p.m. se realizó hasta alcanzar la fase estacionaria (36 horas).

Cultivo de C. utilis en medio hidrolizado de bagacillo de caña de azúcar. Para establecer las características de crecimiento de la cepa de C. utilis en el medio formado con hidrolizado de bagacillo de caña de azúcar y suplementado con 10 mL de medio mineral estéril con la siguiente composición: KH₂PO₄ (2,00 kg/m³), (NH₄)₂SO₄ (14,00 kg/m³), MgSO₄ (0,50 kg/m³), CaCl₂ (0,42 kg/m³) y extracto de levadura (0,01 kg/m³).

El cultivo se realizó en fiolas de 500 mL, por triplicado, con un volumen de 100 mL de medio de crecimiento e inoculado con 10 mL de suspensión de levadura (10⁶ a 10⁷ unidades formadoras de colonias). El crecimiento del cultivo a 30 °C y 220 r.p.m. se realizó por 20 horas (tiempo para alcanzar la fase estacionaria del crecimiento).

Caracterización de las levaduras S. cerevisiae y C. utilis. Las levaduras cultivadas fueron caracterizadas en lo concerniente a su contenido de proteínas (método de Kjeldah)(954.01) y minerales (968.08) (Espectrofotómetro de Absorción Atómica Perkin Elmer, modelo 31310, Norwalk, Connecticut., USA)(A.O.A.C., 1990).

Análisis estadístico. Para comparar los resultados del crecimiento microbiano de las dos levaduras en el hidrolizado ácido concentrado de bagacillo de caña de azúcar, se aplicó la prueba t student de comparación de medias para un nivel de significancia P= 0,01 (Montgomery,1991)

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En el Cuadro 1 se puede observar la composición del bagacillo de caña de azúcar.

El análisis de dicho cuadro permite establecer que los contenidos de celulosa, hemicelulosa y lignina se encuentran dentro de los rangos correspondientes a la composición de los materiales lignocelulósicos (40-60 %, 20-40 % y 10-25 %, para celulosa, hemicelulosa y lignina, respectivamente) indicados por otros investigadores (Colina et al. 1998; Ferrer et al., 2001; Krisna et al., 1998).

Se puede observar una alta composición en carbohidratos (celulosa 52,25 % y hemicelulosa 19,27 %) lo cual permite considerar a este desecho agroindustrial como un potencial material para obtener azúcares solubles mediante hidrólisis ácida (sacarificación).

Hidrólisis ácida y concentración del hidrolizado. El contenido de azúcares reductores del hidrolizado fue 16,21±1,24 kg/m³, el cual se concentró a 34±1,63 kg/m³ en una hora de evaporación al vacío, mediante la reducción de volumen del hidrolizado en un 65 %.

Crecimiento microbiano. La Figura 1 presenta las curvas de crecimiento de S. cerevisiae y el consumo de sustrato (glucosa) en medio definido con el tiempo. Se destaca la máxima producción de biomasa (6,96 ±0,04 kg/m³), una tasa específica de crecimiento (pendiente de la recta de crecimiento exponencial) de 0,08±0,002 h^-1, un rendimiento en biomasa de 0,07±0,001 kg/kg de sustrato y un 38 por ciento de consumo de sustrato.

La Figura 2 representa la cinética de crecimiento de S. cerevisiae y del consumo de sustrato (azúcares reductores) en hidrolizado concentrado de bagacillo de caña de azúcar. Las características del crecimiento incluyen: máxima producción de biomasa de 4,90± 0,03 kg/m³, tasa específica de crecimiento de 0,0141 ± 0,0001 h^-1, rendimiento en biomasa de 1,19± 0,012 kg/kg sustrato y 8,0 por ciento de consumo de sustrato.

El análisis del crecimiento de S. cerevisiae en hidrolizado concentrado de bagacillo de caña de azúcar, al compararlo con el crecimiento en un medio definido, indica que el hecho de producirse una concentración de biomasa, un porcentaje de consumo de sustrato y una tasa específica de crecimiento menores, no influye en el rendimiento en biomasa, ya que este se incrementó sustancialmente al producirse 1,19 kg de biomasa por cada kg de sustrato consumido, lo cual sugiere que el microorganismo utilizó como sustrato algún carbohidrato que no fue medido como azúcar reductor.

Es importante destacar que las tasas específicas de crecimiento y los rendimientos de la levadura S. cerevisiae, encontrados en este estudio, se encuentran dentro de los valores reportados por otros investigadores (Ferrer et al., 1996; Kosaric et al., 1989; Lyutskanov et al., 1990).

Con respecto a la C. utilis, la cinética de crecimiento y consumo de sustrato (glucosa) en medio definido se presenta en la Figura 3.

En dicha figura se observa una producción máxima de biomasa de 19,70 ± 0,05 kg/m³ y un 54 % de consumo de sustrato. Así mismo, para este cultivo se obtuvo una tasa específica de crecimiento de 0,11 ± 0,002 h^-1 y un rendimiento de 0,20 ± 0,01 kg de biomasa por kg de sustrato consumido.

Para el crecimiento de C. utilis en hidrolizado concentrado de bagacillo de caña de azúcar (Figura 4), los resultados obtenidos fueron: 9,45 ± 0,01 kg/m³ de producción máxima de biomasa, 11,6 % de consumo de sustrato, 0,0544± 0,0001 h^-1 de tasa específica de crecimiento y un rendimiento de 1,86± 0,040 kg de biomasa/kg sustrato consumido.

El análisis comparativo del comportamiento de la levadura C. utilis, creciendo en estos dos sustratos, indica que a pesar de alcanzar valores menores de biomasa, consumo de sustrato y tasa específica del crecimiento en el hidrolizado, el rendimiento en biomasa fue nueve veces mayor.

La literatura científica reporta valores similares para estos parámetros cuando la levadura C. utilis se desarrolla en diferentes sustratos (Alroy y Tannenbaum, 1973; Nigan, 1999; Tobajas y García-Calvo, 1999).

Es importante destacar que al comparar la producción de proteína unicelular para S. cerevisiae y C. utilis, utilizando como sustrato hidrolizado ácido de bagacillo de caña de azúcar, en fase líquida, la levadura C. utilis produce 48 % mas biomasa para la misma concentración de sustrato.

El análisis estadístico aplicado al crecimiento de las dos levaduras en hidrolizado ácido concentrado de caña de azúcar (ver Cuadro 2) indicó que la producción de biomasa, el rendimiento y la tasa específica de crecimiento presentaron diferencias significativas, con un nivel de significancia P= 0,01, lo cual infirió que la levadura Candida utilis es la mejor levadura a usar en este bioproceso.

Caracterización de las levaduras. El Cuadro 3 presenta la composición de las levaduras estudiadas en base seca. La comparación de estos componentes con otras fuentes de proteínas tradicionales permite establecer que ambas levaduras tienen un contenido de proteínas y minerales (Ca, P y Mg) mayor que la carne magra, las sardinas frescas, la carne de pollo, el atún enlatado, los huevos de gallina y la soya (Instituto Nacional de Nutrición, 1994).

Estudios reportados por otros investigadores (Lyutskanov et al., 1990; Parajó et al., 1995, Pessoa et al., 1996) sobre el contenido de ácidos nucleico de estas levaduras, indican valores de 1,4 % y 0,5 % para S. cerevisiae y C. utilis, respectivamente.

Con respecto a la calidad de la proteína unicelular, la Cuadro 4 muestra una comparación entre el contenido de aminoácidos de las levaduras S. cerevisiae y C. utilis, con granos de soya y alimento para rumiantes. Es importante destacar que las proteínas de levaduras tienen un alto valor nutricional, caracterizadas por un perfil de aminoácidos balanceado con un elevado contenido de lisina y treonina, lo cual le confiere un extraordinario potencial para su uso como complemento de dietas de cereales para animales, ya que estos son deficientes en estos aminoácidos (Bhattacharjee, 1970; Kihlberg, 1972).

CONCLUSIONES

Se produjo concentrados proteicos de las levaduras S. cerevisiae y C. utilis, para suplementar la alimentación de bovinos y caprinos, mediante el aprovechamiento biotecnológico del desecho generado en el procesamiento industrial de la caña de azúcar.

La hidrólisis con ácido sulfúrico diluido (6% v/v) y una relación líquido/sólido de 30, mediante 4 horas en ebullición a reflujo, de bagacillo de caña de azúcar permite obtener azúcares reductores solubles, los cuales sirven de medio de cultivo para el crecimiento de las levaduras S. cerevisiae y C. utilis, no tóxicas para los animales.

La C. utilis superó a la S. cerevisiae en la producción de biomasa (proteína unicelular) en un 48 %, para la misma concentración de azúcares reductores, provenientes del hidrolizado ácido concentrado de bagacillo de caña de azúcar. El análisis estadístico indicó que la C. utilis es la mejor levadura a usar en este bioproceso.

El elevado contenido de lisina y treonina, así como un contenido balanceado de aminoácidos, sugiere un uso potencial de los concentrados proteicos producidos como complementos de dietas de cereales, ya que éstos son deficientes en estos aminoácidos.

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