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Revista Colombia Médica, Vol. 40, No. 1, Enero-Marzo, 2009, pp. 103-113 Malaria: eficacia de amodiaquina-sulfadoxina-pirimetamina, estado nutricional y variantes alélicas del gen CYP2C8* Malaria: efficacy of amodiaquine-sulfadoxine-pyrimethamine, nutritional status and alellic variaton of CYP2C8 gen Jaime Carmona-Fonseca, MD1, Valentina Guzmán-Pérez, Nutr2, Amanda Maestre-Buitrago, PhD3 1Profesor Titular, Facultad de Medicina, Grupo Salud y Comunidad, Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia. * Investigación financiada por Colciencias (código 1115-04-16497; contrato RC-253-20043), la Dirección Seccional de Salud de Antioquia y la Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia. Recibido para
publicación noviembre 19, 2007 Code Number: rc09013 RESUMEN
Problema: La respuesta terapéutica antimalárica depende de
múltiples determinantes asociados con el plasmodio (especie,
mutaciones, cantidad, etc.) y al hospedero (nutrición, genes,
metabolismo, etc.), pero los últimos son poco conocidos. Palabras clave: Citocromo P-450; Amodiaquina; Malaria; Desnutrición; Selenio; Ferritina; Retinol. SUMMARY
Problem: Therapeutic response to antimalarials depends on multiple determinants
associated with the parasite (species, mutations, parasitaemia, etc.)
and the host (nutrition, genes, metabolism, etc.), but little is known
about the host factors. Keywords: Cytochrome P-450; Amodiaquine; Malaria; Malnutrition; Selenium; Ferritin; Retinol. ¿Cuánta de la falla terapéutica antimalárica se debe a factores del hospedero como su constitución genética del CYP450 y el funcionamiento de las enzimas que él controla? ¿Interviene en la respuesta al tratamiento antimalárico el estado nutricional del paciente? La medición de la eficacia terapéutica antipalúdica cuenta con protocolos estandarizados1. La resistencia genética parasitaria es el rasgo más conocido de causa de falla del tratamiento. En cuanto al hospedero, además de sus estados nutricional e inmune, una pobre absorción, un metabolismo alterado, hipoproteinemia, acelerado metabolismo del compuesto, pueden afectar la respuesta terapéutica2. El metabolismo de la gran mayoría de los medicamentos antipalúdicos depende básicamente del sistema de oxidasas de función mixta, sistema microsomal o citocromo P-450 (CYP450), compuesto por 30 familias de enzimas (citocromos)2-4. El CYP450 humano tiene gran variación genética5,6 que involucra más de 57 genes del sistema7,8. Esa gran variación genética permite clasificar a las personas en metabolizadoras lentas, extensas y ultrarrápidas8 según la expresión fenotípica, es decir, de la actividad funcional de sus enzimas. La identificación de las enzimas CYP450 aporta una base para saber cómo se espera que se comporten farmacocinéticamente esos medicamentos administrados individualmente o en combinación y para ayudar a predecir interacciones medicamento-medicamento in vivo9. El Cuadro 1 resume información básica sobre relaciones entre enzimas del citocromo P-450 y medicamentos antimaláricos9-19. La AQ se elimina activamente en el hígado (>70%), mientras que la quinina y el artesunato (metabolizado éste por esterasas y enzimas hepáticas, pero no CYP45020) son de eliminación intermedia (30%-70%), y la cloroquina (CQ), la pirimetamina y la dapsona se eliminan todavía más lentamente por esa vía hepática (<30%)9. La transformación de AQ a N-desetilamodiaquina (DEAQ) es la principal ruta de disposición en los humanos y la enzima CYP2C8 es la isoforma hepática que contribuye 100% a la conversión de AQ en DEAQ9. Las enzimas extrahepáticas CYP1A1 y 1B1 también eliminan AQ y catalizan la formación de un metabolito que no ha sido identificado9. La subfamilia CYP2C representa aproximadamente 20% del total del contenido hepático de CYP450 y, dentro de ella, el más abundante es 2C9, seguido de 2C8 y 2C1921. La enzima CYP2C8 tiene una estructura molecular conocida22 y es el miembro más fuertemente inducible de la subfamilia CYP2C23. El gen CYP2C8 codifica la enzima que metaboliza parcialmente la CQ y totalmente la AQ; este gen tiene al menos diez variantes alélicas24, como 2C8*2 y 2C8*3 (ésta tiene dos mutaciones); esas variantes están asociadas con el metabolismo incompleto de medicamentos, así cuantificado al comparar su actividad con la de la variante 2C8*1, que es el tipo silvestre («normal»)25 (Cuadro 2). En España, la variante más frecuente de CYP2C8 es 2C8*326 (30%); existe asociación en la aparición de los alelos CYP2C8*3 y CYP2C9*226. En personas caucásicas, afroamericanas y asiáticas hay relativamente poca diferencia étnica en el polimorfismo de once genes pertenecientes a tres subfamilias (CYP1, 2 y 3) que intervienen en el metabolismo de medicamentos, entre ellos CYP2C8, pero hay gran diferencia entre los genes y entre las tres subfamilias genéticas; además, de las tres subfamilias, la 2 presenta los mayores niveles de diversidad genética27. La farmacogenética es el estudio de las respuestas con base genética que se presentan frente a los xenobióticos, incluidas las drogas28,29. La mayoría de los medicamentos son efectivos apenas entre 25%-60% de los pacientes, por causa multifactorial30. La evaluación fenotípica (medición de la actividad de la enzima sobre un sustrato conocido) ha avanzado bastante. En el año 2004 se informó sobre el desarrollo y validación de doce pruebas semiautomáticas para medir la actividad de sustratos marcadores de CYP450 humano, donde se incluyó la amodiaquina como sustrato31. La relación entre la eficacia terapéutica y, por otra parte, la actividad y la estructura genética del CYP450 ha sido poco estudiada. Una reciente revisión sistemática sobre el tema2, apenas halló un artículo, el estudio de Kaneko et al.32, hecho en Vanuatu, Melanesia, con 95 pacientes con malaria que recibieron tratamiento con proguanil, un profármaco que se convierte a cicloguanil, el metabolito activo contra Plasmodium. Un metabolismo lento de la AQ podría representar un riesgo potencial de efectos adversos porque el medicamento permanece más tiempo en los tejidos33. Las infecciones o el estímulo inflamatorio generan cambios en la actividad y expresión de varias formas del CYP450 hepáticas y extrahepáticas (cerebro, riñón)2. La dieta y el estado nutricional pueden modificar la farmacocinética o metabolismo de medicamentos mediados por el CYP450; la primera representa probablemente la vía más significativa para la exposición a compuestos químicos; por su parte, el estado nutricional, el estado de salud, las restricciones dietéticas o la corrección de la desnutrición con suplementos nutricionales deben ser considerados en el momento de analizar el comportamiento de un medicamento y la evaluación de su ruta terapéutica2. La inflamación causada por las infecciones, como la malaria, reduce la actividad del complejo enzimático del CYP-4502, que es activado o inducido por las dietas hiperproteicas y el consumo de ácidos grasos (CYP3A y CYP2A1), mientras que es inhibido por el kwashiorkor, dietas deficientes en carbohidratos, o en ácidos grasos, o en vitaminas A, E, C, B2, niacina, o en Fe, Zn, Ca2. El paludismo, la desnutrición y los parásitos intestinales afectan intensamente a los niños (3 a 11 años) de Turbo (Urabá) y El Bagre y Zaragoza (Bajo Cauca)34-36. Parece lógico pensar que todas estas condiciones influyan en el metabolismo de los antimaláricos y otros medicamentos2. Los autores del presente artículo han estudiado la eficacia terapéutica de varios antipalúdicos en el departamento de Antioquia (Colombia)37-39. En Colombia, entre1961 y2003, la falla terapéutica de la AQ fue de 22% en promedio; por otra parte, la falla terapéutica de la combinación AQ con sulfadoxina-pirimetamina (AQ-SP) fue 11% en Tadó (Chocó) y 2% en Turbo y El Bagre (Antioquia)40,41. En el caso del paludismo, es poco lo que se conoce sobre las relaciones entre la respuesta al tratamiento antipalúdico (en particular con AQ), el estado nutricional del paciente y el genotipo del CYP2C8. Este informe presenta los resultados de una investigación efectuada en pacientes con malaria por Plasmodium falciparum no complicada, tratados con AQ-SP, en quienes se evaluaron la respuesta terapéutica, el estado nutricional y las variaciones alélicas del gen CYP2C8. METODOLOGÍA Clase de estudio y tamaño de la muestra. Los pacientes de este estudio hacen parte de una investigación más amplia, encaminada a evaluar la respuesta terapéutica ante varios tratamientos, en los municipios de Turbo y El Bagre y Zaragoza, en el departamento de Antioquia, Colombia40,41. Esa investigación siguió un diseño clínico controlado, balanceado, no ciego, donde los grupos se evaluaron en forma secuencial y el orden fue definido en forma aleatoria; los pacientes se captaron a medida que llegaban al puesto de malaria. La respuesta terapéutica se evaluó según el protocolo OMS-19981. En esa investigación se trabajó en general, con muestras de tamaño 50 en cada municipio (100 pacientes por tratamiento), con seguimiento por 21 (AQ, SP) ó 28 días (AQ-SP). Los 33 pacientes de este informe hacen parte del grupo de 90 personas evaluadas con el esquema AQ-SP41 en Turbo y El Bagre, en 2003; de esos 33 enfermos se tiene información de las variables respuesta terapéutica, índice de masa corporal, concentración en sangre de ferritina, selenio y retinol y genotipo CYP2C8. Esos 33 pacientes fueron tomados al azar entre los 90 del estudio completo. El procedimiento de muestreo se hizo con una lista de números aleatorios generada por computador (programa Epidat 3.1). El tamaño de la submuestra (n=33) se determinó por conveniencia, considerando dos aspectos: el costo de estudiar cada paciente (exámenes de ferritina, selenio y retinol, y genotipo CYP2C8) y la idea de que se trataba de una aproximación inicial al asunto de la relación CYP450-respuesta terapéutica. Este informe corresponde a un análisis descriptivo y prospectivo. Población de referencia. Las regiones de Urabá y Bajo Cauca aportan 90% de los casos de paludismo del departamento de Antioquia y fueron recientemente descritas por los autores34-36. Turbo (Urabá) está situado en un lugar cuyas coordenadas son 8° 05´ 42´´ N, 76° 44´ 123´´; El Bagre (Bajo Cauca) está en 7° 35´25´´ N, 74° 48´ 27´´. La población de referencia para este estudio son hombres y mujeres mayores de un año, residentes en áreas urbana o rural de los municipios de Turbo y El Bagre, atendidos de forma ambulatoria en los puestos de malaria de dichos municipios, con malaria no complicada y debida exclusivamente a P. falciparum. Criterios de inclusión. Todos los pacientes de este trabajo fueron captados según el orden de llegada, siempre y cuando cumplieran los criterios de inclusión, sin que ninguna otra condición interviniera; tales criterios los fija el protocolo OMS-1998 y son:
Tratamiento de los pacientes y evaluación de la respuesta terapéutica. La AQ se administró en dosis de 25 mg/kg distribuida en tres fracciones de 10, 7.5 y 7.5 mg/kg/día durante tres días consecutivos. La sulfadoxina se administró en dosis de 25 mg/kg y la pirimetamina 1.25 mg/kg, ambas en dosis única. Todo medicamento se administró bajo supervisión directa del médico tratante. La respuesta terapéutica se clasificó así:
a.
Falla temprana: indica presencia de signos de malaria grave en el
día 1 ó 2 del seguimiento o cuando existe una mayor
parasitemia el día 2 ó 3 con respecto al recuento del
día de ingreso del paciente. Evaluaciones practicadas al paciente:
Genotipificación de CYP2C8.Las muestras de sangre total se depositaron en papel filtro Wathman N° 3 y se almacenaron a -20°C. La extracción del ADN se realizó con la técnica estándar de Chelex. Mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y el polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (PCR-RFLP), se analizó el gen CYP2C8. Las condiciones de las PCR y de las restricciones realizadas, así como todas las modificaciones realizadas se detallan en el Cuadro 3. Las variantes CYP2C8*2 (Il29F) y 2C8*3 (R139K y K399R) se determinaron con los cebadores y enzimas descritas por otros autores26, con modificaciones (Cuadro 3). Los productos de amplificación (5 µl) para la variante 2C8*2 (312 pb) se incubaron con 1U de la endonucleasa BclI (Fermentas®) y se analizaron en geles de agarosa al 4%. La digestión en fragmentos de 214 y 98 pb se observó en la forma silvestre del gen. La variante CYP2C*3 se evaluó mediante protocolo ya descrito26: El primer par de cebadores identificó la mutación R139K en el exón 2 del gen; el producto de esta PCR (347 pb) fue incubado con la endonucleasa Bse RI, la cual digirió el producto silvestre (CYP2C8*1) en fragmentos de 310 y 37 pb. Las confirmación de patrones heterozigóticos se realizó mediante secuenciación de los productos purificados (Macrogen®)45. Las secuencias resultantes fueron editadas con el programa Bio edit 7.0. Análisis estadístico de los datos. La información obtenida se procesó con los programas EpiInfo versión 6.04 y SPSS versión 10.0. En todos los análisis se consideró estadísticamente significativa una probabilidad menor de 0.05 (5%). El análisis de los datos siguió esta estrategia:
Aspectos éticos. El proyecto fue aprobado por el Comité de Ética del Centro de Investigaciones Médicas de la Facultad de Medicina de la Universidad de Antioquia. De cada paciente se obtuvo su consentimiento informado escrito antes de ingresar al estudio. RESULTADOS Se evaluaron 33 pacientes con paludismo por P. falciparum, 64% de ellos de sexo masculino; su edad osciló entre 7 y 60 años (27% menores de 18 años) (Cuadro 4). La parasitemia asexual presentó un promedio de 8,096 parásitos/ml (media geométrica 4,501) y una desviación estándar de 8,810 parásitos/ml. Del total de pacientes 25% presentó hasta 2,140 parásitos/ml, 50% hasta 4,640 y 75% hasta 11,760. La parasitemia fue mucho mayor en los grupos de edad menores a 18 años, con respecto a los mayores de edad, pero la diferencia no fue significativa. Las tres «variables» que se evaluaron en función del objetivo de este trabajo presentaron estos resultados: la respuesta terapéutica fue adecuada (exitosa) en todos los 33 pacientes, lo que concuerda con el resultado en la totalidad de 90 pacientes, en quienes hubo éxito terapéutico en 98%40,41. El estado nutricional en los niños correspondió a «riesgo de desnutrición global» (según el indicador peso para la edad) en 66% de ellos. En los adultos, se halló 35% con sobrepeso. Las medianas de las concentraciones de los micronutrientes fueron: retinol 40 µg/dl, ferritina 32.3 µg/dl y selenio 4.28 µg/dl (Cuadros 4 y 5). De los 33 pacientes, 10% presentó deficiencia de retinol (<20 µg/dl) y 25% de selenio (<4 µg/dl); en la ferritina, 15% mostró menos de 12 µg/dl (deficiencia grave), 20% tienen menos de 18 (moderada) y 40% tienen menos de 23 (leve). Ningún paciente presentó concentraciones sanguíneas superiores al rango establecido como normal para estos micronutrientes. La correlación lineal simple de la concentración de micronutriente contra la edad o la parasitemia fue muy baja y no significativa. La correlación (coeficiente r) entre los valores de micronutrientes también fue muy baja (retinol-ferritina r= 0.194; retinol-selenio r= 0.244; ferritina-selenio r= -0.043) y no significativa (siempre p>0.10). La genotipificación de las variantes 2C8*2 y 2C8*3 se hizo en 69 muestras de los 33 pacientes tratados con AQ-SP, con estos resultados:
En forma resumida puede afirmarse que:
a. todos los pacientes tratados con AQ-SP presentaron respuesta terapéutica exitosa; DISCUSIÓN El hallazgo más notorio en los individuos tratados con AQ-SP fue la presencia de polimorfismos genéticos en CYP2C8, en forma heterocigótica, en 3% (1/32) de los pacientes; esta frecuencia es superior a la encontrada en Papua Nueva Guinea, donde no se hubo variación del gen CYP2C8 (todos los niños examinados fueron homocigotos)44 y es menor que la informada en: Zanzíbar (África oriental) en 2005 (13.9%)33; en el norte de Ghana (África), entre 200 escolares tomados al azar (2C8*2: 16,75%; ausencia total de 2C8*3 y 2C8*4)45; en Burkina Faso (África occidental) (en 275 pacientes con paludismo: 15% CYP2C8*2, 0.03% CYP2C8*3)46. En los pacientes con malaria de Burkina Faso no se halló evidencia de la influencia de esos dos polimorfismos sobre la eficacia o la toxicidad de la AQ, pero el tamaño de la muestra (n=275) limitó esas conclusiones46, por lo que persiste la pregunta sobre la influencia del polimorfismo de CYP2C8 en el metabolismo de la amodiaquina47. La escasa frecuencia de polimorfismo del gen CYP2C8 en la población del presente estudio facilita el uso de AQ para tratar la malaria falciparum, porque, desde el punto de vista genético, la población responderá adecuadamente al medicamento. La evaluación de los polimorfismos genéticos del CYP2C8 se hizo con la técnica RFLP modificando el protocolo descrito por Dai et al.25 que mostró excelentes resultados para la identificación de la variante 2C8*2 (Il29F), pero no para la variante 2C8*3, la cual comprende dos mutaciones (R139K y K399R), pues sólo se pudo evaluar la primera. Algunas posibles razones para este tropiezo son:
a. escasa cantidad de ADN en la muestra de sangre almacenada en el papel filtro; Las dos explicaciones previas no concuerdan con el hecho de que fue posible amplificar la otra variante; quizás los cebadores usados no eran apropiados para detectar la segunda variante. Estos resultados concuerdan con los obtenidos en un grupo de Tumaco (Nariño, Colombia), tratados con monoterapia con AQ. Sus muestras de sangre habían sido recolectadas meses antes por investigadores del CIDEIM (Cali, Colombia), entidad que nos facilitó muestras en papel de filtro. Se trató de 23 pacientes (13 hombres y 10 mujeres), en 12 de los cuales hubo falla terapéutica. El análisis genético lo hicimos exactamente como se procedió con los del presente informe. Todas las 23 muestras amplificaron y se incluyeron en el análisis. Se identificó la variante R139K de CYP2C8*3 y no el alelo K399R. Tres de los 23 pacientes presentaron la variante CYP2C8*2 en forma heterozigótica y dos de los tres mostraron falla del tratamiento. Dos de los 23 pacientes presentaron la variante R139K de CYP2C8*3 y ambos presentaron falla terapéutica con la AQ. No se encontró asociación estadísticamente significativa entre la respuesta terapéutica y el genotipo de 2C8 (p>0,05) (datos sin publicar). En el años 2005 se informó sobre la validación de una técnica de genotipificación para las variantes del CYP2C8 que permite, por medio de múltiples PCR, la identificación de tres polimorfismos incluyendo los evaluados en el presente estudio48, lo que permite reducir el tiempo y el costo del procesamiento de las muestras en los estudios poblacionales. Pocos estudios han evaluado la presencia de estas variantes alélicas en pacientes con malaria. Se ha demostrado que el CYP2C8 es bastante polimórfico, factor que puede ser responsable de la variación de los parámetros farmacocinéticos informada en otros trabajos15. Este informe es el primero en dar cuenta en pacientes maláricos de Latinoamérica sobre la variabilidad genética de este gen, lo cual se debería relacionar en futuros estudios con los parámetros farmacocinéticos de la AQ y con el fenotipo de la enzima. Se sabe que la presencia de estas variantes alélicas reduce el metabolismo del plaquitaxel, medicamento anticanceroso y, por tanto, no se debe descartar que estas variantes sean responsables en este caso del metabolismo inadecuado del antimalárico o de los efectos citotóxicos relacionados con la quinoneimina, compuesto formado en el metabolismo de la AQ capaz de unirse irreversiblemente a proteínas celulares49. La ausencia de falla terapéutica en este grupo de pacientes tratados con AQ-SP no permitió el análisis de relación entre RTA, estado nutricional y polimorfismos del gen CYP2C8. Es notorio el elevado porcentaje de pacientes con deficiencia de selenio o de ferritina (20% cada uno). No hay estudios en Colombia que evalúen el estado del selenio en suero o plasma. El selenio es crítico para la actividad del CYP450 tanto intestinal como hepático; el intestinal debe ser abastecido por la alimentación, puesto que su ausencia tiene graves repercusiones en el contenido total y la actividad de las enzimas en la vellosidad intestinal; el hepático, por su parte, puede obtenerse a partir de las reservas corporales del micronutriente50,51. AGRADECIMIENTOS A los pacientes por aceptar participar en la investigación. REFERENCIAS
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