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Revista Colombia Médica
Universidad del Valle - Facultad de Salud
ISSN: 0120-8322 EISSN: 1657-9534
Vol. 40, Num. 3, 2009, pp. 347-352
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Reacción en cadena de la polimerasa y diagnóstico molecular
Revista Colombia Médica, Vol. 40, No. 3, 2009, pp. 347-352
Reacción
en cadena de la polimerasa y diagnóstico molecular
Polymerase chain reaction and molecular diagnostics
Victoria
Eugenia Villegas, MSc1, Magda Carolina Sánchez, MSc1,
Lilian Chuaire, PhD (c)2
Code Number: rc09048
RESUMEN
La PCR, acrónimo de la reacción en cadena de la
polimerasa, revolucionó el campo del diagnóstico molecular, hasta
el punto de que en la actualidad representa el segmento de mayor crecimiento
en los laboratorios clínicos del mundo entero, en los que se ha convertido
en herramienta de invaluable utilidad. El presente escrito describe los fundamentos
de la
metodología, así como algunas de sus múltiples aplicaciones
en la diagnosis, desde sus albores hasta el presente.
Palabras
clave: PCR; Métodos; Utilización; Historia.
SUMMARY
PCR, acronym of polymerase chain reaction, has revolutionized the field
of molecular diagnostics to the point that it currently represents the
fastest-growing segment
in clinical laboratories worldwide, where it has become an invaluable tool.
This paper describes the fundamentals of PCR and its developments in
some of its many
applications in the
diagnosis, from its beginnings to the present.
Keywords: PCR;
Methods; Utilization; History.
Hace cerca de 25 años hizo su aparición la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR), metodología encaminada
a obtener cantidades grandes de ADN para su
utilización en el laboratorio clínico. Este evento tuvo lugar en
forma más o menos reciente, si se considera que desde
1953 se habían descrito, tanto la estructura doble hélice de la
molécula de ADN como las reglas de complementariedad que
la rigen1, y de haberse logrado avances importantes en comprender
los procesos de transcripción de los ácidos
nucleicos y traducción en proteínas de los organismos
eucarióticos2-5.
Con antelación al advenimiento de la PCR y ya en los albores de
la década de 1970, la tecnología del ADN recombinante era
la única forma posible de estudiar la estructura y
función de los genes eucarióticos. No obstante lo dispendiosa,
esta tecnología tuvo la ventaja de permitir el aislamiento de cantidades
relativamente grandes de ADN puro, producto
de la replicación que, durante la división celular, se efectuaba
en el ADN recombinante de los plásmidos o de los vectores que antes se
habían transferido en microorganismos, usualmente bacterias. En 1970 se
habían descubierto las
endonucleasas de restricción, enzimas bacterianas que cortan el ADN en
sitios específicos6,7. Estas enzimas,
más conocidas como enzimas de restricción, fueron claves
en el éxito de la nueva tecnología, pues gracias a ellas, el ADN
de interés se podía aislar e insertar en un vector determinado,
con el fin de formar moléculas recombinantes de
ADN. A pesar de sus múltiples aplicaciones, entre las que se encuentran
la obtención de cantidades grandes de proteína
pura, la identificación de mutaciones, la identificación del estado
portador de enfermedades hereditarias, la transferencia de genes de un organismo
a otro y el mapeo de genes en los cromosomas, lo
tedioso de la tecnología del ADN recombinante hizo que muchos investigadores
pensaran en opciones diferentes, que también ofrecieran la ventaja de
recuperar cantidades grandes de ADN.
Hacia 1983, esa inquietud llevó a Kary Mullis, en ese entonces investigador
de la Cetus Corporation de Emeryville, California, a
desarrollar un método simple para la obtención un
número ilimitado de copias de una secuencia específica de ADN en
un tubo de ensayo. Su objetivo consistía en analizar una
mutación responsable de una enfermedad genética humana, para lo
cual trabajaba en la síntesis de las sondas
oligonucleótido que se requerían. Con base en los experimentos
llevados a cabo en 1971 por Kleppe et al.8, quienes desarrollaron
el primer sistema artificial de
replicación con dos cebadores del que se tiene noticia, la idea de Mullis
giraba en torno a descubrir cómo iniciar y
además detener la acción de una enzima de tipo polimerasa sobre
puntos específicos de una sola de las cadenas del ADN, con el objetivo
de amplificar el ADN blanco en forma exponencial. Entonces,
mediante la utilización de dos cebadores, Mullis
consiguió que, después de aplicar en forma repetida la polimerasa,
se generara una reacción de replicación en
cadena que amplificó el segmento genómico de su
interés9. Sin embargo, cuando quiso mostrar los resultados
de la amplificación, éstos no se pudieron visualizar en el gel
de agarosa, lo que lo llevó a pensar que la
reacción en cadena no mostraba especificidad por la
región amplificada. Sin embargo, más adelante, estas dudas se aclararon
en forma satisfactoria, cuando los productos de la
amplificación pudieron ser visualizados con la técnica Southern
Blot. La visualización de la señal fue la evidencia de la efectividad
de la reacción en cadena de la
polimerasa, pues se comprobó que ésta era capaz de amplificar el
ADN de interés en forma específica. Estos resultados sirvieron
además para optimizar las condiciones
experimentales de la reacción. Desde comienzos de 1980, el ensayo Southern
Blot (llamado así en honor de su inventor Edwin
Southern) adquirió mucha popularidad en el ámbito del
diagnóstico molecular, gracias a su aplicación para descubrir secuencias
génicas específicas y mutaciones
responsables de enfermedades genéticas, así como de ciertos agentes
infecciosos (Chlamydia trachomatis y Neisseria
gonorrhoea)10.
La ejecución de este ensayo implica seccionar el ADN en fragmentos que
contengan la secuencia o la mutación de
interés, para lo cual se utilizan enzimas de restricción. Mediante
electroforesis en un gel de agarosa, los fragmentos se separan
por tamaño y se transfieren a una membrana de nylon o de nitrocelulosa,
con la finalidad de obtener una réplica del gel.
A continuación la membrana se incuba con el gen clonado o con una sonda
oligonucleótido complementaria, de manera que se
produce la hibridación de los fragmentos de ADN que contienen la secuencia
genómica analizada11.
Una vez validada la nueva técnica que desarrolló Mullis, el camino
para utilizar la PCR en los primeros análisis
moleculares y en el diagnóstico prenatal de algunas enfermedades humanas
quedó despejado. Así, unos de los primeros investigadores en
acogerla fueron Saiki et al.12, quienes en 1985 decidieron aplicar
el ensayo, con la finalidad de descubrir la
mutación en el gen de la hemoglobina responsable de la anemia falciforme,
en el ADN fetal de células recolectadas por amniocentesis y muestreo de
las vellosidades coriónicas. Sus excelentes resultados confirmaron la
bondad de la técnica,
así como su viabilidad en aplicaciones diagnósticas
clínicas específicas. En este orden de ideas, no
resultó extraño que los laboratorios de
investigación, en los que hasta ese momento predominaba el uso
de tecnologías de blotting, tomaran la decisión de
adoptar la reacción en cadena de la polimerasa como el
método de elección para el diagnóstico molecular y se convirtieran
así en laboratorios clínicos.
La simplicidad de la PCR, sumada a la facilidad que provee para controlar
las condiciones de la reacción, a la factibilidad de
analizar mínimos volúmenes de diferentes tipos de muestras y a
sus múltiples aplicaciones en los campos de la
genética, las enfermedades infecciosas y el cáncer, han hecho de
la reacción en cadena de la polimerasa la herramienta
más poderosa hasta ahora conocida y de uso más extendido
en el área del diagnóstico molecular y en el seguimiento de las
terapias utilizadas13.
Aplicaciones de la reacción en cadena
de la polimerasa en la medicina actual. Una de las mayores ventajas de
la PCR radica en la facilidad de
efectuar un diagnóstico a partir de pequeñas muestras, que se pueden
conseguir por medio de métodos como cepillado,
aspiración, biopsia e incluso a partir de material de archivo fijado o
embebido en parafina. Su elevada sensibilidad es la
característica que permite demostrar las mutaciones causantes de enfermedades,
además de funcionar como marcador biológico
de diagnóstico temprano en cáncer y en la
identificación de agentes patógenos en medios diluidos14.
Obtención de huellas de ADN. Aunque
las pruebas de paternidad no forman parte del diagnóstico
médico, sí constituyen un excelente ejemplo del empleo de ADN como
huella genética. La PCR ha enriquecido este tipo de
análisis por medio de la identificación de secuencias
génicas propias de un individuo y/o de su descendencia15.
Con el objetivo de obtener huellas de ADN, se pueden utilizar mini o
microsatélites, también conocidos como VNTR (del
inglés variable number tandem repeats) o repeticiones en
tándem de número variable. Los VNTR se encuentran en todos los
organismos eucariotas, incluyendo al ser humano, en el que se
han estudiado ampliamente.
En forma semejante, se pueden identificar otras secuencias
típicas de procariotas (regiones altamente conservadas en el ARN ribosomal),
que también funcionan como huella genética, lo que hace que este
principio sea aplicable para descubrir agentes
patógenos oportunistas en pacientes inmunosuprimidos, como los VIH positivos,
o en muestras de líquido cefalorraquídeo
de enfermos con meningitis16-18.
Debido a la lentitud y a la escasa sensibilidad de los métodos convencionales,
que implican el establecimiento de cultivos celulares,
así como de largos períodos de incubación y/o
observación histológica, la huella de ADN es un instrumento de
gran utilidad en la clínica, en especial cuando la vida del paciente depende
de una rápida y exacta
identificación del patógeno. La agilidad provista por la PCR para
el diagnóstico molecular de las enfermedades infecciosas facilita la toma
de decisiones e incide en la
disminución de la morbi-mortalidad asociada con la
patología diagnosticada19. Así por ejemplo, la
identificación mediante PCR del Mycobacterium tuberculosis o bacilo
de Koch tarda cuatro horas, tiempo irrisorio si se compara con las seis semanas
que este microorganismo tarda en ser detectado en
cultivo20.
Con respecto a la detección y tipificación del papilomavirus humano
(VPH), la PCR sustituyó a la prueba rutinaria de Papanicolaou (PAP), que
aunque útil, posee poca reproductibilidad. Propiedades como sensibilidad
y especificidad son en la PAP muy variables y dependen de la experiencia de las
personas que
la llevan a cabo, lo que hace que más de 50% de las infecciones causadas
por el VPH pase desapercibido21,22. En la
actualidad, un PCR múltiplex se utiliza para el
diagnóstico simultáneo de enfermedades de
transmisión sexual causadas por el virus del herpes, el papiloma
y Chlamydia.
Detección de mutaciones. El diagnóstico
de ciertas enfermedades genéticas o de susceptibilidad a las mismas se
puede efectuar en muestras de sangre,
mediante la identificación de mutaciones o polimorfismos en un gen. Para
esto, primero se amplifica por PCR el segmento génico que se sospecha
afectado, y a continuación se puede optar por
aplicar alguna técnica que permita diferenciar entre los segmentos provenientes
de individuos afectados y los de los sanos utilizados como control. Aunque este
concepto de la variabilidad
genética humana en el que se apoya la prueba es en apariencia sencillo,
su aplicación ha revolucionado el campo del
diagnóstico, en virtud de que hace posible establecer si la
alteración estructural de un gen es hereditaria o adquirida o si se
desarrolla o no con la edad.
Algunas pruebas diagnósticas de rutina que se fundamentan en la PCR, son
las diseñadas para identificar distrofias musculares de tipo Duchenne
o Becker. Estas pruebas examinan la presencia de
mutaciones en la región promotora del gen de la distrofina,
así como la deleción de exones en el mismo, hechos que en cualquier
caso son responsables de generar una proteína
anómala23. El diagnóstico de la enfermedad de Huntington
se puede efectuar mediante la evaluación del
número de repeticiones CAG que se han insertado cerca del origen
del gen24. Con respecto al cáncer de tipo heredofamiliar, son
identificables, en caso de cáncer de mama, las mutaciones en los genes
supresores tumorales BRCA1 y BRCA225, así como en el cáncer
gástrico lo son las mutaciones en el gen CDH126. Con base
en la detección de mutaciones específicas, es
posible además diagnosticar mediante PCR, leucemias, linfomas y
síndromes mielodisplásicos, entre otros27.
Una ventaja del diagnóstico temprano de susceptibilidad a una enfermedad
de origen genético mediante PCR consiste en que
permite, no sólo introducir cambios en el estilo de vida, la
alimentación o aun farmacoterapia en el paciente, con el fin de detener
o retrasar la manifestación de la enfermedad, sino
también efectuar un seguimiento supervisado.
PCR cuantitativa. Derivada de la PCR
convencional, la PCR cuantitativa es una técnica que tiene como fin medir
la cantidad de ácidos nucleicos presentes en una muestra de tejido. Esta
característica hace real la posibilidad de medir la carga viral (cantidad
de ARN viral que se halla en una muestra de sangre) en pacientes infectados
con VIH28 o con el virus de la hepatitis C29, de evaluar
la expresión génica en diferentes tipos de tejido30,31,
de servir como biomarcador en la demostración temprana de enfermedades
y en especial de tumores, así como seguir la
respuesta a medicamentos14.
En el caso del VIH, la principal aplicación de la PCR no se orienta a
determinar si la persona está o no infectada, sino a
evaluar, previa medición de la carga viral, la efectividad de las medicaciones
utilizadas en el tratamiento de la enfermedad. La carga viral, en conjunto con
el recuento de las células CD4+,
indican el estado del sistema inmunológico en estos pacientes32.
En adición, muestras que contienen genomas virales para los que
el huésped aún no ha formado anticuerpos se pueden analizar mediante
la PCR cuantitativa, circunstancia que suministra la oportunidad de controlar
la replicación viral durante los
estados tempranos de infección y, por tanto, de disminuir el
daño celular, como se ha demostrado en tejido hepático29.
Otra aplicación muy popular de la PCR cuantitativa está en el diagnóstico
prenatal no invasivo, cuyo fundamento reside
en el análisis de los ácidos nucleicos presentes en las
células fetales circulantes en el plasma materno33.
Perspectivas. A un poco
más de 25 años de su invención, la humanidad ha sido testigo
de la versatilidad de las aplicaciones de la PCR. El desarrollo de la potencialidad
de esta técnica no fue producto del azar sino de la sorprendente creatividad
de investigadores que, con
base en un concepto tan simple como la obtención de copias de ADN a partir
de un molde, hicieron posible que los beneficios de la
técnica se extendieran más allá del campo del
diagnóstico, para trascender hacia otras áreas de la medicina y
la biología.
Avances en el tamaño del producto amplificado (cada
día mayor) así como en la eficiencia y refinamiento de los equipos
utilizados, no son difíciles de prever. Los
termocicladores serán cada vez más pequeños y los tiempos
de ciclaje más cortos. Será factible reconocer
más de una región de ADN o de ARN por experimento, los reactivos
serán más eficientes y disminuirán los
costos asociados.
Sin embargo, aunque la utilización de la PCR con fines de
diagnóstico y seguimiento de enfermedades continuará, de acuerdo
con su creador Kary Mullis «…debemos comprender que su uso para
amplificar la información genética y
mejorar la secuenciación pronto quedará eclipsado: se
hallará una forma de avanzar sin necesidad de amplificar el
ADN»33. Mullis se refería a los progresos experimentados
por el naciente campo de la nanotecnología,
técnica que promete producir cambios significativos en los
métodos de diagnóstico, así como en el empleo y la
monitorización de la farmacoterapia34. La base de esta nueva
tecnología reside en el uso de nanopartículas encapsuladas en una
matriz de alcohol polivinílico. La matriz modifica la superficie de las
nanopartículas para generar cargas negativas que se acoplan con secuencias
específicas de los ácidos nucleicos. La unión entre las
nanopartículas y el ácido nucleico no sólo sirve para determinar
la presencia de polimorfismos en un solo
nucleótido, sino también para establecer posibles variaciones en
la expresión del ARN.
Es de esperar que los avances en la PCR, sumados a los conocimientos obtenidos
a partir del proyecto del genoma humano y al desarrollo de
nuevas técnicas como la nanotecnología, puedan facilitar, en un
futuro no muy lejano, el desarrollo de nuevas y más sensibles formas de
diagnóstico lo que, a su vez, se
traducirá en métodos de tratamiento más eficaces y
personalizados.
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