VITAE Academia Biomédica Digital Centro de Análisis de Imágenes Biomédicas Computarizadas-CAIBC0 ISSN: 1317-987x Num. 32, 2007

VITAE Academia Biomédica Digital, Número 32, Julio-Septiembre, 2007

Anatomía Patológica

Una actualización sobre la ayuda de los estudios de inmunohistoquímica en el diagnóstico y la evaluación pronóstica de la neoplasia intraepitelial y el cáncer cervical

An updated review on the immunohistochemical studies for diagnostic and prognostic evaluation of cervical intraepithelial neoplasia and invasive squamous cell carcinoma of the uterine cervix

Jorge García Tamayo¹ , Julia Molina² , Eduardo Blasco Olaetxea. ³

¹ novapath@yahoo.com, Anatómo Patólogo Laboratorio de Patología Molecular, Maracaibo, Venezuela
² Laboratorio de Patología Molecular, Maracaibo, Venezuela
³ Instituto Canario de Investigación sobre el Cáncer, Fuerteventura, Islas Canarias.

Fecha de recepción: 16/12/2007 Fecha de aceptación: 20/01/2008

Code Number: va07023

La expresión de proteínas dependientes de genes es evaluada en el epitelio cervical a través de diversos estudios de inmunohistoquímica (IHQ) tanto en la neoplasia intraepitelial cervical (NIC) como en el carcinoma del cuello uterino (CC). La detección de ciertas proteínas como p53, bcl2, C-Myc, Ki 67, Ciclinas, P16 INK4a, p21, p27, β-catenina, Wnt y MCM, es examinada en relación con la evolución de la neoplasia intraepitelial, del carcinoma cervical y de la infección con el virus del papiloma humano (VPH). Se señala como la actividad transcripccional de diversos genes provoca alteraciones de la heterocigosis y pérdida de regiones cromosómicas que influyen en la sobrexpresión de proteínas, o en la pérdida parcial de la expresión de algunas glicoproteínas en la superficie celular como consecuencia de la activación de genes del VPH.

Palabras Claves: Inmunohistoquímica, neoplasia intraepitelial cervical, cáncer cervical, VPH, alteraciones genéticas.

Abstract

Immunohistochemical studies in cervical intraepithelial neoplasia and cervical carcinoma are evaluated in this review in order to identify a variety of proteíns such as p53, bcl2, C-Myc, Ki 67, Cyclines, P16 INK4a, p21, p27, β-catenin, Wnt and MCM. These studies were related to the development of cervical neoplasia and human papilloma virus infection. The role of transcriptional factors of genes inducing loss of heterozygosity, numerical chromosome abnormalities, inactivation of gene products or partial loss of some membrane glycoproteins induced by oncogenic human papillomaviruses (HPV) are also pointed out.

Key Word: Inmunohistochemistry, intraepithelial cervical neoplasia, cervical cancer, HPV, genetical alterations

Introducción

Las displasias del cuello uterino, conocidas como neoplasia intraepitelial cervical (NIC) y el carcinoma infiltrante del cuello uterino (CC),se relacionan con el virus del papiloma humano (VPH) de alto riesgo (1,2). El VPH interfiere en el ciclo celular lo que provoca cambios en oncogenes, y termina produciendo pérdida de la heterocigosis y pérdida de regiones cromosómicas específicas. Estas evidencias, parecen señalar el probable papel de algunos genes supresores de tumores en la génesis del CC (3,4,5).

La expresión de diversas proteínas dependientes de genes en el epitelio cervical puede ser evaluada a través de técnicas de inmunohistoquímica (IHQ). Proteínas como p53, bcl2, C-Myc, Ki 67, Ciclinas, P16 INK4a, p21, p27, β-catenina y MCM han sido examinadas en NIC y en CC utilizando estas técnicas. Algunos resultados de estas investigaciones han creado expectativas entre quienes aspiran lograr evidencias para precisar el pronóstico de NIC y del CC y su relación con el VPH. En este trabajo, revisaremos y evaluaremos el estado actual de estos estudios inmunohistoquímicos.

I

La proteína oncosupresora p53 funciona como guardián de la integridad del genoma de la célula huésped y está encargada de que el ciclo celular progrese tras comprobar que el genoma está intacto. La proteína p53 es producto del gen P53 y ante cualquier daño del ADN, se expresará como consecuencia del freno del ciclo celular a través de p21, un inhibidor del ciclo que provoca fallas en los mecanismos de proliferación celular y en la apoptosis. En la infección por VPH, la muerte celular programada es interferida a través de p53 por el encogen E6 del mismo VPH a través del bloqueo del ciclo celular inducido por el inhibidor de la cinasa dependiente de la ciclina p21 y por Bax. Bax es una proteína proapoptótica presente en los epitelios indiferenciados la cual también puede ser degradada por E6 a través de la ubiquitina (6).Se sabe que P53 es inactivado por la oncoproteína supresora del VPH E6, la cual se une a la proteína p53, y promueve su degradación, por lo que su función se altera durante la infección con VPH de alto riesgo, sin que se produzca una verdadera mutación del gen (7,8,9). La proteína p53 no se expresa en el epitelio cervical normal. No siempre se observa inmunomarcaje para la proteína p53 en CC, y nuestra experiencia en este sentido ha sido similar a la de otros investigadores (10), sin embargo algunos consideran que la presencia de p53 se incrementa con los grados de NIC y con la malignidad por lo que han planteado que este anticuerpo debería detectarse en el CC (11,12,13). Según otros investigadores, a pesar de que la infección con VPH de alto riesgo es la responsable de la sobreexpresión de p53, la expresión de la misma no puede considerarse como un factor de valor pronóstico (14). Finalmente, para otros, no pareciera existir ninguna relación directa entre la positividad para VPH y el inmunomarcaje para p53 (10,15,16).

Bcl 2

La expresión de bcl 2 en el cuello uterino normal, es escasa, sin embargo en NIC y en carcinomas se ha descrito un incremento de la misma (17), por lo que se ha sugerido que la expresión de bcl 2 y de p53 está relacionada con la infección con VPH de alto riesgo (15). Sin embargo, en el estudio del CC y de su relación entre p53 y bcl 2 algunos investigadores presentan resultados contrapuestos que solo pueden ser significativos si se examinan desde un punto de vista estadístico (18), no obstante según otros, con estos anticuerpos no es posible predecir su evolución y menos aún las probables metástasis (19).

C-Myc

C-Myc y Ki 67 aumentan su expresión con la proliferación celular presente en NIC y en cáncer, pero sus resultados no pueden considerarse como de valor pronóstico (20). Existen escasos estudios sobre C-Myc y el CC, por lo que hasta ahora pareciera no existir una relación aparente entre C-Myc y VPH 16-18 (11,20).

Ciclinas

Las ciclinas son moduladores del ciclo celular, algunas están relacionadas con el gen del retinoblastoma (RB) y actúan inactivando la pRb. La oncoproteína E7 del VPH interacciona con el gen RB que controla los factores de crecimiento que mueven el ciclo celular y de esta manera inhibe su función reguladora. Las ciclinas son ubicuitinizadas en el núcleo y pasan al citoplasma celular durante la fase de síntesis para ser destruidas. En el CC la ciclina D1 se expresó en el citoplasma y en casos de NIC se detectó en el núcleo y en el citoplasma (10). Algunos trabajos señalan la importancia de la ciclina-E en diversas neoplasias (21), esta se ha detectado en cáncer de mama (22) y en CC (23,24,25). Se ha descrito también sobreexpresión de ciclina-A en NIC y en CC (26). La identificación de la ciclina D1 resulta útil en otras neoplasias pero su importancia no parece ser relevante en el CC (27).

II

En realidad la expresión de la Ciclina D1 es comparable a la de Ki67. Debe examinarse en detalle la posible relación entre C-Myc y Ciclina D1 pues es interesante observar que como ocurre con Ki67, tanto C-Myc como la Ciclina D1 se asocian con una mayor proliferación celular como se observa en el CC activado por VPH de alto riesgo (28).

β-catenina

En realidad ambas, Ciclina D1 y C-Myc son dianas de la vía WNT/APC/ β-catenina Como resultado de la activación de la vía Wnt, se produce acumulación de β-catenina en el citosol del queratinocito lo cual provoca la translocación de β-catenina al núcleo donde va a interactuar con factores de transcripción implicados en la diferenciación celular a través de su grupo amino terminal con la β-catenina para activar la transcripción de genes, como C-Myc y Ciclina D1 los cuales, definitivamente parecieran estar involucrados en los procesos de proliferación y diferenciación celular presentes en el CC (29).

P16 INK4a

P16 INK4a es un inhibidor de la ciclina dependiente de kinasa 4 y se sabe es expresado tanto en NIC como en el CC (30,31). Se ha señalado que no parecen producirse alteraciones genéticas en el gen P16 en casos de CC (32). La actividad de p16 en células normales se produce a través de una inhibición de su proliferación. Se ha señalado también que p16INK4a es un indicador específico para NIC, especialmente en lesiones de alto grado y se destaca el hecho de que este es más específico que Ki67 (32,33). La expresión de p27 y de p21 ha sido comparada con p16 en NIC, sin que puedan hallarse diferencias significativas (34), no obstante al examinar el rol de la Ciclina D1 en el CC, se señala su importancia de valor pronóstico en la expresión de la proteína p16 (35). En un estudio reciente, cuando se examinan casos de CC utilizando matrices de microarrays para estudio de genes, se ha detectado la pérdida de expresión de p16 en casos que mostraron menor sobrevida, sin estar ella relacionada con la profundidad de la invasión ni con las metástasis ganglionares (36). Debe enfatizarse que la proteína p16, es un elemento de la vía p16_ciclinaD-cdk4/6\RB (37). En el estudio inmunohistqoquímico de 212 pacientes con CC estudiados para p16, p21 y p27, se demostró que, si bien con p16 existen resultados esperanzadores, en general estas proteínas no pueden considerarse directamente como factores de valor pronóstico para el CC (34). p27

El ciclo celular está controlado por complejos proteicos compuestos por ciclinas y por ciclinadependientes de kinasas (cdk) que se dividen en dos familias estructuralmente relacionadas, la familia Cip/ kip ( p21, p27 y p57 ) en la cual estas proteínas funcionan como inhibidores preferentemente de cdk2 ( complejos de ciclina A/E–cdk2 ), y la familia INK4 ( p15, p16, p18 y p19 ), que inhibe los complejos que contienen Ciclina D (cyclin D–cdk4/6). La p27 tiene una función reguladora que responde a señales extracelulares, además de sus conocidas funciones en la diferenciación celular y en la apoptosis (38). El encogen E7 del VPH-16 puede unirse a la p27 sin degradarla, una inactivación que no está relacionada con su transformación oncogénica (39). Se ha descrito aumento de la expresión de p27 en el epitelio normal de cuello uterino, (40) lo cual contrasta con la expresión aumentada de p27 en NIC y en el CC (41,42,43). En base a estos hallazgos, se puede concluir que p27 no tiene valor como indicador pronóstico en el CC (34).

p21

La proteína p21 puede verse como la ejecutora de p53, considerando que el gen de p21 está bajo el control transcripcional de p53 (44). La expresión de p21 que está disminuida o ausente en células en reposo, se puede involucrar en el control de la actividad de cdk en células proliferantes, además de su función de respuesta al daño del ADN deteniendo el ciclo celular y participando en su reparación o llevando a la célula a la muerte celular programada. La expresión de p21 desaparece al inactivarse la proteína por acción del oncogen E7 del VPH-16 y aunque pudiera sobrexpresarse por efecto de alguna mutación, su actividad no influye en el control del ciclo celular, ni tiene valor pronóstico en el CC (43). También previamente se había señalado que la disminución en el inmunomarcaje de p21 podría ser un indicador de mal pronóstico (45) Igualmente, el encogen E7 del VPH-16 se puede unir a la p21 inactivada sin degradarla, lo que induce una exagerada actividad de cdk2 a pesar de que existan altos niveles de p21 (46).

Wnt

Las proteínas Wnt constituyen una familia de factores de crecimiento que controla la proliferación, la migración arquitectural y la organogénesis durante el desarrollo embriológico (47). Hallazgos recientes han demostrado que Wnt tiene un papel importante en el desarrollo del cáncer a través de sus receptores y de una vía que se caracteriza por la acumulación de βcatenina en el citoplasma y en el núcleo. Los niveles de β-catenina en el citoplasma son controlados por la fosforilación que induce su ubicuitinización y su degradación (48). En ausencia de Wnt, GSK-3h se activa y fosforiliza la β-catenina degradándola. La activación de la vía de Wnt inhibe la acción de GSK-3h y provoca el exceso de β-catenina citoplasmática. El exceso de βcatenina va al núcleo para formar un complejo transcripcional con el Factor de células T (TCF) el cual se sabe activa la transcripción de genes como C-Myc y la ciclina D1 (49). Una fosfatasa PP2A está también involucrada en la degradación del complejo β-catenina inhibiendo la señalización de Wnt a través de APC y de la axina (50). Se ha descrito un modelo experimental de queratinocitos cultivados en los cuales la transformación que el VPH ejerce sobre ellos, requiere de un segundo golpe y este está representado por la adopción de la vía Wnt y más allá, ésta podría ser uno de los mecanismos para la activación de la transformación maligna del epitelio del cuello uterino. La identificación por IHQ de β-catenina podría tener un interés particular, sobretodo en la exploración de esta vía en NIC y CC (51).

MCM

El análisis de los resultados de estudios realizados en los ratones transgénicos K14E6 y K14E7 que expresaban los oncogenes E6 y E7 y en los que existía hiperplasia epitelial y tumores espontáneos en la piel, demostró como al ser éstos tratados con estrógenos, los roedores desarrollaron cáncer cervical (52). En estudios previos con ratones trangénicos y VPH-16 se había demostrado como el oncogén E7 inactivando la pRb afectaba la expresión de la proteínas p107 y p130, y como también al activar la familia de los factores de transcripción E2F, inducía una respuesta génica con presencia de una proteína que fue denominda “proteína minicromosómica de mantenimiento7” (MCM7). Esta proteína representa un componente de la ADN helicasa inducido por el gen E2F (53). La expresión de MCM7 se producía en el curso de la enfermedad neoplásica en estos ratones transgénicos en quienes la tinción por IHQ estaba limitada a las células parabasales y basales en el epitelio normal e hiperplásico, pero que ocupaba todas las capas epiteliales en la displasia y el cáncer cervical. Ese trabajo demostró con un enfoque experimental, en ratones, que es importante indagar sobre la búsqueda de proteínas biomarcadoras que reaccionen como p16 en los casos de NIC y CC (52). Estos estudios en ratones también demostraron cierto paralelismo entre los resultados con Ki67 y la Ciclina E y los observados en casos de cáncer del cervix humano (32,54,55 ) como ya hemos comentado previamente. Otros modelos de proteínas MCM ( MCM2 y MCM5 ) han sido utilizados como factores de valor pronóstico en el cáncer cervical, (56) y en realidad se sabe que casi todos los genes MCM pueden inducir los factores de transcripción E2F (57). La inestabilidad genómica inducida por los oncogenes virales E6 y E7 potencialmente conducen a la aparición de anormalidades centrosómicas (58), ambos factores, la inestabilidad genómica y las anomalías centrosómicas se han observado en el modelo experimental de los ratones transgénicos. Todos estos cambios genómicos, son los responsables de la expresión anormal de MCM7.

El virus del papiloma humano

Las proteínas E6 y E7 del VPH, son importantes por sus propiedades oncogénicas ya que tienen la capacidad de inmortalizar y transformar las células del cuello uterino y por otra parte mantendrán el ambiente celular para que el genoma viral pueda subsistir mientras no se encuentre incorporado en los cromosomas (4). Algunas de las proteínas que pueden ser examinadas por IHQ dependen de la acción de los oncogenes E6 y E7 del VPH. Con la hibridación in situ (HinS) y amplificando la señal para los virus de alto riesgo con sondas con tiramida biotinilada, hoy día es posible detectar directamente en el epitelio cervical en casos de NIC o de CC, secuencias de ácidos nucleicos virales tan pequeñas como una sola copia, lo cual hace de esta técnica un valioso instrumento para la investigación sobre la infección y la carcinogénesis viral. Hemos examinado la presencia de infección genital con el virus del papiloma humano (VPH) por HinS utilizando sondas biotiniladas de ADN específicas para VPH, de amplio espectro (WS) que comprende los virus tipo 6,11, 16, 18, 31,33,35, 45, 51y 52 ; y de alto riesgo (AR) con los virus tipo 16,18, 31,33,35,39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68. Igualmente y por separado hemos estudiado la presencia de VPH 16 y 18 en casos de NIC y de CC con VPH de AR. Nuestros resultados al utilizar esta metodología permiten una correlación entre los casos de NIC y CC que se estudian para detectar el VPH y las diversas proteínas cuya actualización sobre sus estudios con IHQ hemos discutido previamente(4,6).

Los antígenos de grupos sanguíneos

Las células epiteliales y las secreciones de casi un 80% de las personas tienen ciertos oligosacáridos que se identifican como antígenos de grupos sanguíneos; antígenos estos que se pueden detectar en los epitelios normales y neoplásicos y en sus secreciones, en individuos que por ello se denominan “secretores” (59,60,61). En estudios previos se demostró que los antígenos de grupos sanguíneos ABH se encontraban presentes en las células del epitelio cervical normal (62) y posteriormente se demostraron en el útero neoplásico (63,64,65), sin embargo se ha señalado que la presencia de isoantígenos ABO en el epitelio exo y endocervical de mujeres “secretoras”, no se detecta en las identificadas como no secretoras (66). Desde hace casi veinte años, E Blasco-Olaetxea ha venido examinando el papel de estos oligosacáridos en las neoplasias y en estudios recientes (67) hemos demostrado como en las lesiones premalignas denominadas neoplasia intraepitelial cervical (NIC I y NIC II) hay pérdida parcial de la expresión antigénica de ABH, mientras que en NIC III y en el carcinoma epidermoide infiltrante del cuello uterino, la pérdida de la expresión de estos antígenos de grupos sanguíneos en pacientes “secretoras” es total. La importancia de estos hallazgos y la aplicación de los mismos al realizar un estudio comparativo con diversas lectinas y con p16, relacionan la estructura de los azúcares en la superficie de la membrana celular con señales que son genéticamente controladas y cuya evaluación debe ser de utilidad en el estudio de la carcinogénesis del cuello uterino.

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NOTA: Toda la información que se brinda en este artículo es de carácter investigativo y con fines académicos y de actualización para estudiantes y profesionales de la salud. En ningún caso es de carácter general ni sustituye el asesoramiento de un médico. Ante cualquier duda que pueda tener sobre su estado de salud, consulte con su médico o especialista.

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