VITAE Academia Biomédica Digital Centro de Análisis de Imágenes Biomédicas Computarizadas-CAIBC0 ISSN: 1317-987x Num. 39, 2009, pp. 43-50

Academia Biomedica Digital, Vol. 0, No. 39, , 2009, pp. 43-50

Article

Cambios en la actividad neuronal inducidos por el cadmio y el 17β-estradiol en la zona compacta de la substantia nigra de ratas

Changes in neuronal activity induced by cadmium and 17β-estradiol in substantia nigra zona compacta in rats

AR Noriega-León, AR Torres-Hernández, JA González Vegas

Laboratorio de Neurofisiología, Cátedra de Fisiología, Escuela de Bioanálisis, Facultad de Medicina, Universidad Central de Venezuela, Venezuela

Correspondence Address:A R Torres-Hernández, Laboratorio de Neurofisiología, Cátedra de Fisiología, Escuela de Bioanálisis, Facultad de Medicina, Universidad Central de Venezuela, Venezuela, arelis.torres@ucv.ve

Date of Submission: 12-Jul-2009
Date of Acceptance: 28-Aug-2009

Code Number: va09024

Ha sido reportado que el cadmio (Cd²⁺) tiene efectos similares a los producidos por el estradiol (E₂ ) sobre el útero y las glándulas mamarias. En vista de la importancia del Cd²⁺ como contaminante ambiental, y dado que han sido demostrados efectos del E₂ en varias zonas del sistema nervioso central, se decidió estudiar si a este nivel el Cd²⁺ aplicado iontoforéticamente, tenía efectos similares a los producidos por el 17β-estradiol. Se registraron 12 neuronas en la zona compacta de la Substantia nigra, en las cuales se pudo aplicar tanto el Cd²⁺ como el E₂ a la misma neurona (ambos con una corriente de 40 nA). En éstas el Cd²⁺ y/o el E₂ produjeron cambios significativos y predominantemente excitatorios sobre su actividad. Estos cambios comienzan a observarse hacia el final de la aplicación y su duración es variable, siendo frecuente que se prolongue varios minutos. Ante la aplicación del metal, diez neuronas respondieron incrementando su frecuencia, mientras que una se inhibió y la otra no respondió. La frecuencia control se recuperó en un período que no sobrepasó los 35 minutos. Al aplicar E₂ , ocho neuronas se excitaron y 4 se inhibieron. Estas respuestas se inician más rápidamente que las que produce el Cd²⁺. Se evidenció una alta coincidencia en los efectos del Cd²⁺ y del E₂ (75%) pero con cursos temporales diferentes. Además, en dos células se pudo comprobar que el Cd²⁺ potenciaba el efecto excitatorio del E₂ . Estos resultados sugieren que el Cd²⁺ tiene efectos similares a los del estradiol en la Substantia nigra del sistema nervioso central.

Palabras clave: cadmio, 17β-estradiol, estrógeno, sistema nervioso central, Substantia Nigra, iontoforesis.

Abstract

It has been reported that cadmium (Cd²⁺) has similar effects to those produced by estradiol (E₂) on the uterus and mammary glands. Given the importance of Cd²⁺ as an environmental pollutant, and its effects on the central nervous system, we decided to explore whether cadmium applied iontophoretically has similar effects to those produced by 17β-estradiol in the brain. Twelve neurons in zona compacta of the Substantia Nigra were recorded, in these neurons both Cd²⁺ and E₂ were tested on the same neuron (both applied with 40 nA). In these Cd²⁺ and/or E₂ produced significant changes on their firing rate these being predominantly excitatory. These changes becoming apparent towards the end of the application, and usually lasting for several minutes. When the metal was applied ten neurons responded by increasing its firing rate, while one was inhibited and the other one did not respond. In general, the effect was over within 30 minutes. When E₂, was applied eight neurons were excited and 4 were inhibited. These responses were initiated faster than those caused by cadmium. In summary in 75% of the neurons tested both cadmium and estradiol produced the same effect, but with different time courses. In addition, in two cells it was found that Cd²⁺ enhanced the excitatory effect of E₂. These results suggest that Cd²⁺ has effects, on the firing frequency, similar to those of estradiol on the Substantia Nigra.

Keywords: cadmium, 17β-estradiol, estrogen, central nervous system, Substantia Nigra, iontophoresis

Introducción

La contaminación ambiental por metales pesados (mercurio, plomo, cadmio, etc) es un problema realmente grave, al cual no se le ha prestado suficiente atención y del que apenas estamos comenzando a ver las consecuencias. La utilización de estos y otros elementos contaminantes en la fabricación de productos variados tales como cigarrillos, baterías recargables, recipientes de PVC, aleaciones metálicas, o pigmentos especiales, así como en la producción de compuestos de libre comercio como fertilizantes, pesticidas, herbicidas, fungicidas, etc., generalmente no son acompañados de programas de procesamiento de desechos tóxicos adecuados, o de una política de concientización de la población, sobre todo en los países del tercer mundo. Normalmente estos productos terminan arrojados al ambiente, junto con los desechos comunes, exponiendo a plantas y animales por igual a sus acciones ^{[12],[20],[32],[35]} . Numerosas investigaciones han alertado acerca de las consecuencias que este tipo de elementos tienen en los organismos, siendo especialmente alarmantes los efectos en la capacidad reproductiva, tanto en humanos ^{[24],[36],[44]} como en animales ^[11],[30] . En cuanto al tejido nervioso, estudios demuestran que la acumulación de Cd²⁺ depende de la permeabilidad vascular ^{[4],[5],[6],[29]} . También puede ingresar a través de las neuronas olfativas primarias (por ejemplo en el humo del cigarrillo), y de ellas hacia neuronas secundarias y terciarias ^[40] . El Cd²⁺ también puede atravesar la placenta ^[19],[28] y ser expulsado con la leche materna ^[34] . Se han descrito los efectos neurotóxicos del Cd^{2+ [45]} , y los cambios en los sistemas de neurotransmisores ^[10],[29] . Ha sido propuesto que los efectos del cadmio (Cd²⁺) parecen deberse a que este metal forma complejos que pueden interactuar con los receptores para estrógeno en órganos como el útero y las glándulas mamarias, lo cual explicaría los efectos estrogenizantes observados ^{[2],[9],[27],[39]} . Son también conocidos los efectos que produce el Cd²⁺ sobre ciertos canales, incluyendo el bloqueo inespecífico de los canales de calcio voltajedependientes ^{[18],[25],[3]} . Por otra parte, el sistema nervioso ha mostrado ser un tejido altamente sensible a las hormonas sexuales, no sólo durante las etapas tempranas del desarrollo ^[26],[31] , sino también en el tejido ya maduro, en el cual modifica la actividad neuronal ^{[1],[3],[13],[14],[17],[37],[41],[42]} . Se sabe además, que las áreas que responden a ellas no son sólo las implicadas en el control neuroendocrino (eje hipotalámico-hipofisiario), sino que abarcan extensas zonas del sistema nervioso central y periférico ^[8] . Por ello decidimos evaluar si el Cd²⁺ tiene efectos similares a los producidos por el estradiol (E₂) en el SNC. Se escogió la zona compacta de la Substantia Nigra (zcSN) porque trabajos anteriores demuestran que esta estructura, involucrada en el control motor, responde a la aplicación iontoforética de E₂ ^{[13],[14],[42]} . En el presente trabajo se evalúan y comparan los cambios en la actividad eléctrica de las neuronas nigrales luego de aplicar Cd²⁺ y E₂ a la misma neurona, mediante la técnica de microiontoforesis.

Materiales y métodos

Se utilizaron ratas machos de la variedad Sprague-Dawley, con un peso comprendido entre 250-300 gr. Las ratas fueron mantenidas en grupos de 4-5 animales, en jaulas metálicas, en ambiente con períodos de luz-oscuridad controlados de 12 horas c/u (6:00 am a 5:59 pm luz; 6:00 pm a 5:59 am oscuridad) a temperatura y humedad ambientales. Se les suministró agua y alimento ad libitum. Se utilizó solución de Uretano al 20% como anestésico general (1g/Kg; i.p.) y solución de Lidocaína al 2% como anestésico local. La zcSN fue abordada estereotáxicamente utilizando las coordenadas siguientes, obtenidas del atlas de Paxinos y Watson, 1982 (33): AP= 5-5,5 mm; L = 1,5-2 mm; V = 6-7 mm. Se empleó un microelectrodo múltiple de vidrio (3-5 μm Ø) para el registro de la actividad eléctrica de las neuronas y para la aplicación microiontoforética del Cd²⁺ (CdCl2, 0,25 mM; pH 7.4) y del estradiol (hemisuccinato de 17b-estradiol, 0,25 mM; pH 7.4) directamente en la zcSN. La actividad eléctrica de las neuronas de la zcSN se registró mediante técnicas electrofisiológicas convencionales, utilizando la barra central del microelectrodo de vidrio, la cual contenía una solución de azul de pontamina al 2% en acetato de sodio 0,5M y con una resistencia de 1-10 MΩ. En primera instancia, las espigas fueron identificadas como pertenecientes a la zcSN sobre la base de criterios electrofisiológicos previamente establecidos como: (1) forma y duración de la onda de cada potencial de acción, (2) frecuencia de descarga, y (3) patrón de descarga característicos de esta zona ^{[21],[22],[23]} . La actividad espontánea inicial de cada célula fue registrada de manera continua, por un período no menor de 20 minutos para comprobar su estabilidad, antes de proceder a aplicar pulsos de Cd²⁺ o de E₂ (40 nA x 5 min, c/u). Posterior a la aplicación, se registró la actividad hasta la recuperación. Los pulsos se aplicaron en orden aleatorio (primero el Cd²⁺ seguido de E₂ o viceversa). En dos células a las que previamente se les había probado el efecto del Cd²⁺ y del E₂ por separado, se procedió a aplicar de manera consecutiva los dos pulsos, con apenas 5 minutos de separación, comenzando con el de Cd²⁺ y posteriormente con el de E₂. En el presente estudio se consideraron como cambios significativos aquellas variaciones de la frecuencia de disparo de al menos un 50% de aumento (excitaciones) o de disminución (inhibiciones) en relación con la frecuencia promedio registrada durante el period inicial. Al finalizar cada registro, se procedió a marcar la zona haciendo pasar una corriente de 20 μA durante 20 minutos a través de la barra de registro llena con la solución de azul de Pontamina. El cerebro fue fijado prefundiendo al animal aún anestesiado con una solución de formol al 10 % por vía intracardíaca. Posteriormente, la ubicación exacta del sitio de registro de cada neurona fue corroborada histológicamente. Equivalente a la realización de una curva dosis-respuesta, en el presente trabajo se procedió a realizar una curva corriente-respuesta. Para ello, se aplicó el Cd²⁺ a las neuronas nigrales con pulsos de corriente de intensidad creciente, partiendo de 10 nA, hasta 200 nA, con incrementos progresivos de 10 nA. Los efectos significativos se observaron claramente a partir de 40 nA. Se decidió utilizar este valor de corriente para realizar el estudio sobre el efecto del Cd²⁺ en la actividad neuronal, por dos razones: (1) es el mismo valor de corriente al cual se han venido observado y estudiando los efectos del E₂ sobre las mismas neuronas, en estudios anteriores realizados en nuestro laboratorio y (2) se prefiere utilizar la mínima intensidad necesaria para observar los efectos, a los fines de minimizar los cambios producidos por la corriente propiamente dicha, sobre la excitabilidad neuronal.

Resultados

Se estudiaron un total de 12 neuronas de la zcSN, a las cuales se les probó tanto el efecto de la aplicación microiontoforética de Cd²⁺ como de E₂, según el protocolo propuesto. Como ha sido descrito en las ratas adultas, las neuronas de la zcSn son afectadas por la aplicación microiontoforética de E₂, en las cuales puede producir tanto efectos excitatorios como inhibitorios ^[42] . En este estudio, la mayoría de las neuronas respondieron excitándose ante la aplicación del E₂ (8 de 12). Estas excitaciones se caracterizaron por ser de rápida aparición después de comenzada la aplicación del pulso de E₂ (2±1 min). La máxima excitación se observó también muy rápidamente (4±1 min). En cambio, la duración de estos efectos fue muy variable, pudiendo observarse en algunos casos una recuperación casi inmediata, mientras que en algunas neuronas este efecto se prolongó hasta por 20 minutos después de terminado el pulso de la hormona. Aunque el criterio inicial para considerar significativo un cambio en la frecuencia de descarga fue de 50%, todos los cambios superaron en mucho este criterio, observándose incrementos de hasta 300%. Así mismo, se pudo comprobar que la aplicación de Cd²⁺ también tuvo efecto sobre estas neuronas, siendo nuevamente predominante el efecto excitatorio (10 de 12). Similar a lo que ocurrió con E₂, estas excitaciones fueron en su mayoría del orden de 300%. Sin embargo, el curso temporal de estos efectos fue diferente al observado con el E₂. En el caso del Cd²⁺, todas las neuronas comienzan a mostrar un incremento significativo en su frecuencia solo hacia el final del pulso de Cd²⁺, o incluso después de terminado éste (9±5 min). También hubo diferencias en el tiempo de recuperación, ya que con el Cd²⁺, la actividad aumentada se mantuvo en algunos casos hasta por 30-35 minutos. A pesar de estas diferencias en el curso temporal de las excitaciones provocadas por el E₂ y el Cd²⁺, se evidenció una alta coincidencia en los efectos excitatorios del Cd²⁺ y del E₂ en cada célula. En la [Table - 1], se muestra este resultado, observándose que todas las células que se excitaron con el E₂ también se excitaron con el Cd²⁺, independientemente del orden en que fueron aplicados.

Como se mencionó anteriormente, también se observaron efectos inhibitorios sobre las neuronas nigrales, ante la aplicación de E₂ y de Cd²⁺, pero en un menor número de neuronas. Con E₂ se inhibieron 4 neuronas y con Cd²⁺ una sola. En tres de estas cinco inhibiciones se observó un 100% de inhibición en algún momento del período posterior al de la aplicación del pulso, pero este tiempo de máxima respuesta inhibitoria fue muy variable entre célula y célula. También se observó coincidencia entre los efectos inhibitorios de E₂ y Cd²⁺. Como se ve en la [Tabla 1], la única neurona que se inhibió con el metal fue una de las cuatro neuronas que también se inhibió con la hormona. Sólo dos células de las 12 estudiadas, mostraron efectos opuestos, ya que aumentaron su frecuencia de disparo ante el pulso de Cd²⁺, pero se inhibieron con el de E₂. Finalmente, una neurona que no respondió a la aplicación del Cd²⁺, si lo hizo ante el E₂, mostrando una inhibición. En la [Figure - 1] se pueden observar los registros de dos células de la zcSN, en la cual se muestran: (A) una respuesta excitatoria al Cd²⁺, (B) una respuesta inhibitoria al Cd²⁺.

En la [Figure - 2] se muestra un registro continuo de la actividad de una célula en el que se observa tanto el efecto excitatorio del Cd²⁺ como el efecto también excitatorio de E₂. En el mismo registro se puede observar que la magnitud de los cambios producidos por el metal y la hormona sobre la frecuencia de disparo son de magnitudes comparables.

En dos de las células estudiadas se pudo realizar la aplicación de Cd²⁺ y de E₂ dos veces, siendo la separación entre los dos pulsos de unos pocos minutos en la segunda aplicación. En la [Figure - 3] se muestra uno de estos registros, en donde se observa el efecto excitatorio que tienen cada uno por separado sobre la actividad neuronal (ya descritos), y seguidamente se observa que durante la segunda aplicación del E₂, la magnitud del efecto excitatorio se incrementa de manera importante al ser precedido por el pulso de Cd²⁺, alcanzando una respuesta máxima de aproximadamente 15 veces la actividad basal, mucho mayor que la que alcanzó por sí solo en la misma célula 20 minutos antes. Además en esa célula se observa que una vez terminado el pulso de E₂, la actividad tiende a recuperar su nivel inicial, pero muestra brotes de actividad aumentada, aunque de menor magnitud y duración que el producido durante la aplicación de la hormona.

Discusión

Los resultados obtenidos muestran que la aplicación iontoforética de Cd²⁺ produce cambios en la frecuencia de descarga de las neuronas de la zona compacta de la Substantia Nigra, y, además, que estos cambios son similares a los producidos por la administración de 17b-estradiol. Sin embargo, los cursos temporales mostrados por la hormona y el metal para producir tales efectos si difieren. Estos efectos son de corta latencia, indicando un mecanismo de acción rápido y muy efectivo, aunque reversible, pero los del Cd²⁺ requieren de un tiempo un poco mayor que el de E₂. Anteriormente Rozear y col., 1970 ^[38] habían reportado efectos del Cd²⁺ aplicado iontoforéticamente en las neuronas de la corteza cerebral y tallo encefálico de gatos. Sin embargo, estos autores encuentran que el metal produce inhibiciones en todas, a diferencia del presente estudio en el que la mayoría de las respuestas encontradas (83%) fueron excitatorias, y solo produce inhibiciones en unas pocas neuronas. Estas discrepancias en los resultados pueden deberse a diferencias intrínsecas de las neuronas de cada zona estudiada, o también de la especie empleada en cada estudio. De cualquier forma, en ambos estudios se pone en evidencia el profundo efecto que este metal tiene en la actividad neuronal. Se sabe que el Cd²⁺ es capaz de bloquear canales de calcio voltaje-dependientes ^{[7],[15],[16],[25]} . Mediante este mecanismo, éste y otros metales pesados han mostrado ser potentes inhibidores de la transmisión sináptica, aún a muy bajas concentraciones en el medio. Sin embargo no parece ser este el mecanismo por el cual se puedan explicar las excitaciones producidas por el Cd²⁺, salvo que se invoquen mecanismos de bloqueo de la inhibición ^[43] . En vista de la coincidencia de los efectos del Cd²⁺ y del estradiol, luce más probable que el mecanismo de acción sea a través de la interacción con los receptores estrogénicos, mimetizando así los efectos del E₂ ^{[2],[9],[27],[39]} . La diferencia en el curso temporal de los efectos producidos por la hormona y por el Cd²⁺, puede deberse a que las cantidades liberadas de Cd²⁺ y de E₂ con cada pulso de corriente no son necesariamente idénticas en su actividad biológica, a pesar de utilizarse los mismos parámetros de aplicación. Los efectos producidos por el E₂ fueron más potentes cuando la aplicación de esta hormona fue precedida pocos minutos antes por un pulso de Cd²⁺, lo cual sugiere un efecto potenciador del metal sobre la respuesta al E₂. Esto pudiera deberse a que el mecanismo de acción sea a través de la estimulación de receptores estrogénicos. Los presentes resultados muestran que el Cd²⁺ es capaz de modificar la excitabilidad neuronal y produce cambios similares a los producidos por la estimulación estrogénica, y potenciar los efectos estrogénicos en algunas neuronas. En vista de la importancia creciente del Cd²⁺ como contaminante ambiental, es importante entonces tomar en cuenta que los efectos estrogenizantes del Cd²⁺ también pueden estar presentes en el sistema nervioso central.

Conclusiones

• La aplicación iontoforética de Cadmio en la zona compacta de la Substantia Nigra, modifica la frecuencia de descarga de estas neuronas.
• La mayoría de las neuronas respondieron al Cadmio con incrementos en la frecuencia de disparo.
• De manera similar, la mayoría de las neuronas estudiadas también respondieron al Estradiol con incrementos de la frecuencia.
• Los cursos temporales mostrados por los efectos del Cadmio y el Estradiol fueron, sin embargo, diferentes. Los períodos de latencia, respuesta máxima y recuperación fueron más cortos para la hormona que para el Cadmio.
• Existe una alta coincidencia en los efectos ejercidos por el Cadmio y el Estradiol sobre las células de la zona compacta de la Substantia Nigra. Las 8 neuronas que se excitaron con Estradiol también lo hicieron con Cadmio. La única neurona que se inhibió con Cadmio, también se inhibió con estradiol. Solo 3 neuronas, de las 12 estudiadas mostraron cambios diferentes al serles aplicados los pulsos de Estradiol y de Cadmio.
• Los efectos producidos por el Estradiol mostraron ser más intensos si la aplicación de esta hormona es precedida pocos minutos antes por un pulso de Cadmio, lo que sugiere un efecto potenciador del Cadmio sobre los efectos del Estradiol.

References

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