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Zootecnia Tropical, Vol. 20, No. 4, 2002, pp. 501-513 NOTA TÉCNICA Determination
of saxitoxin and its derivatives in mollusk bivalves: Evaluation and optimization
of the high performance liquid chromatographic use with fluorescence detection
and prior oxidation Determinación de saxitoxina y sus derivados en moluscos bivalvos: Evaluación y optimización del uso de cromatografía líquida de alta resolución con previa oxidación Luisa Rojas de Astudillo[1], Iván Chang-Yen[2], Amelia La Barbera-Sánchez[3]
Code
Number: zt02033 SUMMARY Saxitoxin and its derivatives
are potent neurotoxins associated with paralytic shellfish poisoning (PSP)
in humans which are primarily produced by dinoflagellates. To evaluate and
optimize the use of high performance liquid chromatography (HPLC) with previous
oxidation in order to determine saxitoxin and its derivatives, samples of
the green mussel (Perna viridis)
and oysters (Crassostrea sp) were
collected at six locations in Venezuela and at four in Trinidad, the latter
along the west coast line, in June 2000. The samples were extracted using
the AOAC bioassay mouse procedure. Each extract was oxidized using periodic
acid and the oxidation product was injected to the chromatographic column.
The method used to HPLC in this work was a modification of Lawrence et
al. (1996). The separation of important pairs of toxins (STX/NEO, GTX1,4/GTX2,3)
were achieved, but the resolution and height of the peaks of oxidation products
of these toxins varied depending on column efficiencies. Some samples had
presence of PSP below permissible levels, which was confirmed by using bioassay
mouse method. The results showed that the reaction precolumn method gives
prompt information about profile of the toxins, which is independent of matrix
of receptor organism, and it is a simple method for monitoring PSP in shellfish
in the Caribbean. Key words: saxitoxin, PSP, neurotoxin, dinoflagellate, toxic. RESUMEN La
saxitoxina y sus derivados son potentes neurotoxinas que originan afecciones
asociadas a la intoxicación paralizante en humanos (PSP, siglas en inglés)
que son producidas primariamente por dinoflagelados. Con la finalidad de
evaluar y optimizar el uso de la cromatografía líquida de alta resolución
con previa oxidación para la determinación de la saxitoxina y sus derivados
se tomaron muestras de mejillones verdes (Perna
viridis) y ostras (Crassostrea
sp) en seis localidades de Venezuela y cuatro de Trinidad, de éste último
a lo largo de la costa occidental, durante el mes de junio del 2000. Las
muestras fueron extraídas siguiendo el procedimiento AOAC usado para el bioensayo
de ratón. Cada extracto fue oxidado usando ácido peryódico y el producto
de oxidación inyectado a la columna cromatográfica. El método utilizado para
la cromatografía líquida de alta resolución con detector de fluorescencia
correspondió a una modificación del sugerido por Lawrence et al. (1996). Se logró la separación de importantes pares de toxinas
(STX/NEO, GTX1,4/GTX2,3), pero la resolución y la altura de los picos de
los productos de oxidación de esas toxinas variaron dependiendo de la eficiencia
de las columnas utilizadas. Algunas muestras presentaron contaminación por
PSP, pero las concentraciones estuvieron por debajo de los límites permisibles,
las cuales fueron confirmadas por el método de bioensayo del ratón. Los resultados
demuestran que el método de reacción precolumna provee una información rápida
acerca de la composición de las toxinas, independiente de la matriz del organismo
receptor y es un método simplificado para el monitoreo de PSP en moluscos
en el Caribe. Palabras clave: Saxitoxina, PSP, neurotoxina, dinoflagelados, tóxicos. INTRODUCCION La
acumulación de toxinas por moluscos como un resultado de la ingesta de dinoflagelados
tóxicos ha sido un gran riesgo para la salud pública y ha causado grandes
pérdidas a la industria de productos marinos. La más conocida de todas las
intoxicaciones es la intoxicación paralizante por consumo de mariscos (PSP,
siglas en inglés) causada por neurotoxinas que son producidas primariamente
por varias especies de dinoflagelados. Eventos de PSP causados por dinoflagelados
han sido registrados en Venezuela desde hace 25 años y en Trinidad recientemente
(Chang-Yen et al., 1999; Ammons et
al., 2001; La Barbera-Sánchez y Estrella, 1996). Colectivamente esas
toxinas PSP son denominadas saxitoxinas derivando su nombre del Saxidomus
giganteus, en donde la saxitoxina fue originalmente extraída e identificada
(Bates y Rapoport, 1975). Saxitoxina
es el primer compuesto marino cuyo origen se asoció al fitoplancton (Shimizu,
1993). Existen aproximadamente 21 formas moleculares de esas toxinas (Figura
1) que han sido aisladas de dinoflagelados tales como Alexandrium spp., Gymnodinium
catenatum, y Pyrodinium bahamense
var. compressum (Yasumoto et al.,
1995). Todas las saxitoxinas bloquean el movimiento del ión sodio a través
de la membrana celular nerviosa, paralizando el flujo del impulso nervioso
que causan los síntomas de PSP (Mosher et
al., 1964). Saxitoxinas
y sus espontáneas transformaciones son el principal factor de impedimento
para el desarrollo de una simple prueba de campo para medir toxinas (Sullivan
y Wekell, 1988). El
bioensayo de ratón, método aprobado por la Oficina de Administración de Alimentos
y Drogas de los Estados Unidos (FDA, siglas en inglés) como un procedimiento
para detectar y cuantificar toxinas en moluscos, mide simultáneamente todas
las toxicidades del total de saxitoxinas a partir de una muestra de tejido
del molusco. Sin embargo, este método es debil para detectar eficientemente
análogos de saxitoxinas de bajas toxicidades (toxinas B y C, Figura
1) (Casais
Laiño, 1991). I II
STX: Saxitoxina; GTX: Gonyautoxina;
dc: decarbamoyl; do:deoxycarbamoyl Además
del método de bioensayo del ratón, otros métodos químicos como ensayos inmunoenzimáticos
o ELISA (Chu y Fan, 1985), y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
han sido usados para determinar toxinas PSP (Oshima 1995; Lawrence et
al., 1996). Sin embargo, el método más efectivo para confirmar toxicidad
y determinar el perfil de la toxina del organismo afectado es la cromatografía
líquida de alta resolución (HPLC) (Sullivan,1985). Debido a la naturaleza
química de las toxinas PSP, las cuales son altamente polares y carecen de
un cromóforo sensitivo a la absorción de luz ultravioleta, la técnica más
común utilizada en HPLC consiste en obtener un compuesto fluorescente, a
través de una reacción de oxidación, la cual es detectada y cuantificada
por fluorometría (Sullivan et al., 1985; Oshima et al.,
1996; Lawrence et al., 1996). En
este estudio, se planteó como objetivo, demostrar que el método HPLC con
reacción precolumna provee información veraz y oportuna de la composición
química de la saxitoxina y sus derivados. MATERIALES
Y METODOS 1. Muestras Muestras
de mejillones (Perna viridis) y
ostras (Crassostrea rhizophorae y C. virginica)
se recolectaron en bancos naturales en seis localidades de Venezuela ubicadas
en los estados Sucre y Nueva Esparta y cuatro a lo largo de la costa occidental
de Trinidad (Cuadro 1 y Figura 2). El muestreo se realizó en junio de 2000.
Todo el tejido de las muestras fue extraído y almacenado congelado hasta
su análisis. La identificación de las diferentes especies de ostras y mejillones
fue efectuada en el Departamento de Biología de la Universidad de Oriente
(Prof. Antulio Prieto) y con un catálogo de moluscos marinos de las costas
de Venezuela (Lodeiros et al.,
1999). 2. Preparación
de las muestras para el HPLC Las
muestras de ostras (Crassostrea rhizophorae y crassostrea virginica)
y mejillones (Perna viridis)
se extrajeron de acuerdo al procedimiento usado para el bioensayo de ratón
(A.O.A.C, 1990). Cien gramos de tejido licuado y homogenizado fueron hervidos
con 100 ml de 0,1 mol/l HCl. Después de hervir por 5 minutos y enfriado,
el pH fue ajustado aproximadamente a un valor de 3 con NaOH (1mol/l) y
el extracto se centrifugó a 4000 rpm por 12 min. El líquido sobrenadante
se decantó cuidadosamente en un envase plástico y se almacenó a 4°C
hasta que el análisis se realizó. Previo al análisis, un procedimiento
de extracción de fase sólida en microcolumnas (500 mg/3 ml de volumen)
fue aplicado para limpiar las muestras. La sílica gel fue derivada con
modificaciones del procedimiento sugerido por Knapp (1979). Cada microcolumna
usada se acondicionó con 6 ml de etanol, seguido de 6 ml de agua. A cada
microcolumna se le agrego 1 ml de extracto y el efluente se recolectó en
un vial (5,0 x 1,8 cm de diámetro) limpio y prepesado. La microcolumna
fue eluida con 2 ml de agua y el efluente combinado en el vial. El vial
fue repesado y se le adicionó agua desionizada hasta obtener una masa del
extracto de 4 g. Las alícuotas de cada extracto fueron usadas para la reacción
de oxidación con ácido peryódico, previo al análisis con el HPLC.
3. Reacción
de oxidación El
reactivo para la oxidación de las muestras se preparó diariamente de acuerdo
a lo recomendado por Lawrence et
al. (1996), mezclando 5 ml de 0,03 mol/l de ácido peryódico, 0,3 mol/l
de formato de amonio y 0,3 M de Na2HPO4. Se ajusto
el pH a 8,2 usando 0,2 mol/l de NaOH. En un vial de 1,5 ml, se preparó una
mezcla de 100 ml de extracto de molusco
o de estándar y de 500 ml del reactivo oxidante con un mezclador vortex.
La solución se dejó reaccionar a temperatura ambiente por 1 minuto, se
le agrego 5 ml de ácido acético glacial y se mezcló para estabilizar el
producto de la reacción. La mezcla se dejo en reposo por 10 minutos adicionales
a temperatura ambiente antes de ser inyectada al sistema cromatográfico. 4. Análisis
cromatográfico El
sistema de cromatografía líquida consistió de una bomba de gradientes (LKB
Model 2249) un puerto de inyección (Rheodyne, Model 2494) para 20 ml
de muestra. Se usaron cuatro columnas de fase reversa y C18 de
diferentes casas comerciales. Un espectrofotómetro de luminiscencia (Perkin
Elmer, Model LS50B) fijado a 330 nm (excitación) y 400 nm (emisión), ajustado
a una celda de flujo para cromatografía líquida de alta resolución, fue
usado para monitorear el efluente de la cromatografía líquida. Se usó una
fase móvil por gradiente de acuerdo a Lawrence et
al. (1996), esto es: 0-1% acetonitrilo los primeros 15 minutos y 1-
4% los 7 minutos restantes. Las concentraciones de las toxinas se determinaron
por comparación del área del pico de cada toxina con los de los patrones
calibrados. Las
soluciones certificadas de calibración que contienen STX, NEOSTX, GTX1,4,
GTX2,3 utilizadas para preparar la curva de calibración fueron obtenidas
del National Research Council of Canada. RESULTADOS
Y DISCUSIÓN Con
el método de cromatografía líquida de alta resolución con detección de fluorescencia
y reacción previa se conformó la detección de saxitoxinas por su espectro
de absorción y emisión (Figura 3). La saxitoxina presentó el mismo tiempo
de retención en su cromatograma, como toxina individual y en una mezcla con
GTX1,4, NeoSTX, GTX2,3 (Figura 4), lográndose la separación de importantes
pares de toxinas (STX/NEO, GTX1,4/GTX2,3), pero la resolución y la altura
de los picos de los productos de oxidación de esas toxinas variaron dependiendo
de la eficiencia de las columnas utilizadas. Con reacción precolumna es difícil
separar los epímeros GTX1 de GTX4 y GTX2 de GTX3. El
orden de elusión de las toxinas en los cromatogramas obtenidos estuvieron
en concordancia con lo planteado por Lawrence et
al. (1995). El rendimiento fue de 85-104% por adicionar concentraciones
conocidas de toxinas a muestras no contaminadas. El límite de detección
fue de 10 mg PSP/100 g de tejido de
molusco comparado con 40 mg PSP/100 g obtenido por el bioensayo con ratones.
Con respecto a las muestras analizadas, solamente gonyaulatoxina GTX2,3
fue detectada en muestras de Chaguaramas (Perna
viridis), Trinidad, Guiria (C.
virginica), Río Caribe (Perna
viridis) y Yaguaraparo (C. virginica),
estado Sucre, Venezuela (Cuadro 1, Figura 2); en concentraciones que estuvieron
por debajo de los límites permisibles (<80 mg/100 g tejido fresco).
La baja toxicidad de las muestras fue confirmada por la técnica de bioensayo
del ratón, en la cual, los ratones sólo presentaron algunos síntomas asociados
a PSP, pero no murieron. Esto impidió calcular con exactitud la toxicidad
real de la muestra. Los
valores de toxinas PSP encontrados fueron bajos; sin embargo, su presencia
indica un riesgo potencial para los humanos, por lo que es necesario implementar
el desarrollo de estudios en áreas de crecimiento de moluscos bivalvos que
permitan proteger la salud pública. CONCLUSIONES Los
resultados demuestran que el método de reacción precolumna provee una información
rápida acerca de la composición de las toxinas, independiente de la matriz
del organismo receptor. Además, resulta un método simplificado para el monitoreo
de toxinas PSP en moluscos del Caribe, zona que incluye a Trinidad y a Venezuela
y en la cual las células de algas tóxicas son movilizadas, concentradas o
dispersadas por los vientos, mareas y corrientes marinas, y donde probablemente
los moluscos filtradores llegan a ser más tóxicos que en las áreas con concentraciones
más altas de estas algas. RECOMENDACIONES Continuos
estudios son necesarios para mejorar la identificación y cuantificación de
los diferentes derivados fluorescentes usando el método de cromatografía
líquida de alta resolución, que logren separar aquellos pares de toxinas,
tales como: GTX1 de GTX4 y GTX2 de GTX3, hasta ahora no logrado con el método
de oxidación previa. AGRADECIMIENTOS El
financiamiento para realizar esta investigación fue aportado por el por el
Consejo de Investigación de la Universidad de Oriente, The University of
the West Indies y por el Consejo Nacional de Investigaciones Científicas
y Tecnológicas (CONICIT). Se agradece la colaboración prestada por la Embajada
de Venezuela en Trinidad, la Guardia Nacional de Venezuela, el Instituto
de Investigaciones Biomédicas (IIBCA), el Instituto Oceanográfico de Venezuela,
y el Instituto de Estudios del Mar de la UDO. BIBLIOGRAFÍA
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