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Zootecnia Tropical, Vol. 21, No. 1, 2003, pp. 27-41 Masculinización de la trucha arco iris, Oncorhynchus mykiss, para obtener descendencia todas hembras en un criadero venezolano Masculinization of the rainbow trout, Oncorhynchus mykiss, to obtain descendant all-females in a Venezuelan fish hatchery Hilda R. Bastardo1* y Sara B. Sofía B. [1] Instituto Nacional de Investigaciones
Agrícolas (INIA) Code Number: zt03003 SUMMARY The sex reversion technique is widespread in many countries of North America and Europe to get all-female trouts. The development of these techniques is desirable because trout males reach their gonad maturity at the first year of age, while the female do it after two years of age. The objective of this research was to masculinizate trouts to get genotypic females with capacity to produce semen and behave as a functional male. The sex reversion is produced by feeding the animals for 932 °C/days with food containing 3 mg/kg of 17 α-methyl testosterone. We found 57% sex reversal female, 27% with atrophic gonad, and 16% were not affected by the treatment. The offspring of the crossing between normal female and sex reversal female were 100% females, while the control group displayed a sex ratio of 1:1. The products of this research are of mayor importance for the trout farmer in Venezuela because this technology would allow reducing the fattening cycle, increasing the profit. Key words: All female trout, mixed-sex trout, sex reversal, masculinization, methyl testosterone. RESUMEN La obtención de truchas todas hembras, a través de la masculinización de las hembras es ampliamente utilizada en muchos países de Norteamérica y Europa. El desarrollo de técnicas de control sexual es económicamente deseable en los salmónidos, debido a que los machos alcanzan la madurez gonadal al año de edad, mientras que las hembras lo hacen después de los dos años. El objetivo del presente trabajo fue masculinizar las truchas para obtener ejemplares genotípicamente hembras, capaces de producir semen y comportarse como machos funcionales. Para la masculinización se utilizó 3 mg de 17α-metil testosterona por cada kg de alimento, suministrado durante 75 días. Después de este período de alimentación continuaron con su dieta normal hasta el final del experimento. Los resultados encontrados indican que el 57% de las hembras del grupo experimental se masculinizaron, 27% presentaron gónadas atrofiadas y 16% no fueron afectadas por el tratamiento. La progenie procedente del cruce entre hembras normales y hembras masculinizadas presentó una relación de sexo donde el 100% de la progenie fue hembra, mientras que el grupo control presentó una relación 1:1. Los productos logrados a través de esta investigación son de gran importancia para los productores de trucha de Venezuela, ya que la incorporación de esta tecnología en este sistema productivo permitirá acortar el ciclo de engorde, incrementando los rendimientos en la explotación de este salmónido. Palabras Clave: Truchas, todas hembras, ambos sexos, reversión de sexo, masculinización, metil testosterona. INTRODUCCIÓN Los estudios sobre el control de diferenciación de sexo en peces teleósteos caen dentro de tres categorías generales basadas en el tipo de técnica utilizada. La primera involucra el uso de andrógenos o estrógenos, los cuales anulan los mecanismos endógenos de determinación del sexo en el desarrollo del embrión o causa un retardo en el desarrollo gonadal lo que conduce a esterilidad. La segunda técnica conduce a la obtención de una progenie toda hembra o totalmente macho, bien sea que se utilice ginogénesis o androgénesis. La ginogénesis es una forma especial de partenogénesis en la cual el esperma activa el desarrollo de los huevos sin contribución del material genético. La androgénesis es la situación reversa, en la cual solo el esperma contribuye con el material genético. La tercera categoría incluye las técnicas de radiación, uso de químicos, auto inmunidad y técnicas de esterilización quirúrgica (Donaldson y Hunter, 1982). Los cambios de sexo por tratamientos hormonales también pueden producir poblaciones monosexuales. Aunque el genotipo macho o hembra se determina en el momento de la fecundación, el fenotipo sexual ocurre posteriormente durante el desarrollo, especialmente en el momento del inicio de la alimentación. Este fenotipo puede alterarse por la administración de estrógenos para producir todas hembras o andrógenos para obtener poblaciones todas machos (Pérez, 1996). Los primeros estudios sobre el efecto del tratamiento con andrógenos en trucha fueron realizados por Ashby (1957), quién colocó alevines de trucha en agua que contenía 50 a 60 µg/l de testosterona después de 850°C/días de fertilización y llevado hasta 1738°C/días. Los resultados obtenidos por este autor no fueron muy claros; sin embargo, evidenciaron la utilidad de la testosterona en inhibir la diferenciación de sexo. El rápido desarrollo del cultivo de salmónidos durante la década de los 70 en Europa y Norteamérica incrementó el interés en controlar el sexo de estos peces, debido a los beneficios de obtener poblaciones totalmente hembras. La madurez sexual en los salmónidos generalmente produce un efecto detrimental en piscicultura por la movilización de la energía para el desarrollo de las gónadas por lo tanto la tasa de crecimiento somático es baja (Happe et al., 1988). Donaldson y Hunter (1982) concluyeron que a pesar de las numerosas técnicas utilizadas para la producción de salmónidos 100% hembras o estériles solo pocos procedimientos han conducido a su aplicación en los sistemas de producción. En la actualidad esas técnicas son ampliamente utilizadas en Norteamérica y Europa. El tratamiento directo de estrógenos en alevines y larvas puede ser exitoso para la producción de lotes de truchas totalmente hembras, considerando que estos no serán utilizados en programas de reproducción porque altera la relación de sexo en los descendientes ni destinados para el consumo humano por las medidas de regulación en el uso de estrógeno. La técnica más recomendada es la ginogénesis donde el uso de estrógenos es indirecto ya que la masculinización de las hembras permite obtener machos homogaméticos (XX), los cuales se comportan fenotípicamente como machos y genotípicamente siguen siendo hembras. El semen de estos machos funcionales es utilizado para fertilizar las ovas normales y los descendientes de estos cruces son 100% hembras, los cuales pueden consumirse sin restricciones y ser utilizados en programas de reproducción. Los estudios realizados en trucha arco iris han demostrado que la masculinización se obtiene de una manera relativamente fácil, administrando a la dieta de los peces 3 mg de 17α-metil testosterona por kg de alimento, al iniciar su alimentación y durante un período de 1.000 °C/días (Bye y Lincoln, 1986). La obtención de truchas todas hembras, a través de la inducción de machos funcionales es ampliamente utilizada en muchos países de Norteamérica y Europa. El desarrollo de técnicas de control sexual es económicamente deseable en los salmónidos, debido a que los machos alcanzan la madurez gonadal al año de edad, mientras que las hembras lo hacen después de los dos años. En Norteamérica y muchos otros países, esta técnica de mejoramiento genético es ampliamente utilizada para incrementar el crecimiento de los peces y por ende la productividad del cultivo. Sheenan et al. (1999), informa sobre un mayor crecimiento en ejemplares todas hembras en comparación con truchas de ambos sexos. El objetivo del presente trabajo fue masculinizar hembras de truchas para obtener machos funcionales y producir poblaciones totalmente hembras. MATERIALES Y MÉTODOS Alimentación Para la preparación del alimento se utilizó 3 mg de 17 a -metil testosterona previamente disuelto en 200 ml de alcohol isopropílico, por cada kg de alimento. Se mezcló minuciosamente con movimientos envolventes, y luego se colocó en una bandeja formando una capa delgada, la que se dejó secar en una estufa a 350 °C, hasta el día siguiente. Al terminar el proceso de secado se colocó en un envase con tapa y se guardó en el refrigerador. El alimento se suministró durante 75 días, cada 30 minutos durante 9 horas. Después de este período de alimentación se les suministró su dieta normal (dieta control) hasta el final del experimento (18 meses). Se llevó control de mortalidad diaria y cada tres meses se determinó peso y longitud de la población en estudio, hasta el inicio de la maduración gonadal. Manejo de los reproductores Fertilización Antes de realizar la fertilización se hicieron pruebas de motilidad de los espermatozoides, a través de la observación al microscopio de una muestra diluida de semen. La fertilización se realizó utilizando el método seco, previo lavado de las ovas con una solución isohalina. Los huevos se extrajeron de 10 truchas de dos años de edad, a los cuales se les realizó un pool de ovas y se dividió en dos lotes, uno se fertilizó con semen de hembras masculinizadas y el otro con semen de macho normal (control) para evaluar la progenie procedente de ambos grupos. Cuando se fertiliza con semen de hembras masculinizadas se debe mezclar muy bien con las ovas para asegurar que los espermatozoides se liberen, puedan moverse y facilitar el encuentro óvulo espermatozoide. Después de 15 minutos, las ovas se lavan con agua para extraer el exceso de semen y posteriormente se colocan en las incubadoras verticales. Desde el momento de su ubicación en las incubadoras se llevó un control diario de la temperatura del agua y se extrajeron las ovas muertas. La evaluación del material en estudio permitió determinar la relación de sexo en cada uno de los períodos analizados, así como también el porcentaje de hembras normales y el porcentaje de hembras con gónadas atrofiadas dentro del grupo tratado. Se determinó el número de ovas, la fertilidad y sobrevivencia de larvas. El contaje de las ovas se realizó utilizando el método de Von Bayer, ampliamente utilizado por científicos y por piscicultores debido a la sencillez y exactitud del mismo (Piper et al., 1983). El índice gonadosomático (IGS), la fertilidad y la sobrevivencia de larvas se determinaron utilizando las siguientes formulas: Los resultados se analizaron utilizando un análisis de varianza de una sola vía. RESULTADOS Y DISCUSIÓN En el Cuadro 1 se muestra la temperatura promedio del agua durante el periodo de alimentación de las truchas con la hormona (75 días). Los datos corresponden al promedio de tres lecturas de temperatura por día. Después de 932 oC/días de alimentación con la hormona, se continuó con la dieta normal hasta el final del experimento, donde se observó que en el grupo experimental la progenie correspondió a una población totalmente hembra. Bye y Lincoln (1986) obtuvieron resultados similares alimentando durante 75 días y hasta los 1000 °C/días, lo que indica que la investigación se realizó bajo condiciones de temperatura más alta que las registradas en la presente investigación.
Del total de hembras, en el grupo experimental, se encontró que 16,67% no fueron aparentemente afectadas por el tratamiento en cuanto a maduración de las gónadas; el 26,67% presentó gónadas atrofiadas o estériles y el 56,66% de las hembras respondieron al tratamiento hormonal, las cuales se masculinizaron o revirtieron su sexo. Crecimiento y sobrevivencia La sobrevivencia fue menor en el grupo tratado; sin embargo, en ambos casos el valor fue similarmente alto, sin descender del 95%. Los resultados indican que la hormona, utilizada bajo las condiciones del presente estudio no afecta la sobrevivencia de las truchas. Características
reproductivas Las hembras masculinizadas comenzaron a dar muestras de cambios en el desarrollo de las gónadas a partir de enero del año 2000, cuando se observaron diferencias morfológicas entre los testículos de hembras masculinizadas y los de machos normales (Cuadro 2). A partir de ese momento (13 meses) se sacrificaron las truchas mensualmente para asegurar el momento adecuado de maduración de los testículos. Esta actividad se realizó hasta los 17 meses de edad debido a que casi toda la población presentó las gónadas en estado avanzado de maduración y al mes siguiente se realizaron los cruces para evaluar la progenie. A través del análisis microscópico se encontró que hasta los seis meses de cultivo no se observaron óvulos en los gametos de las truchas tratadas con hormona quienes presentaron características parecidas a las de los machos; sin embargo, se consideraron sin determinación de sexo. En la evaluación correspondiente al tiempo de cultivo 9 y 12 meses se observó una relación de sexo similar a la esperada en una población normal (Cuadro 2). A partir de los trece y hasta los 17 meses de cultivo hubo predominio de hembras revertidas o masculinizadas, separándose de la relación 1:1 que caracteriza a las poblaciones naturales. La revisión microscópica realizada a los ejemplares con ovarios del grupo tratado (13 a 17 meses de cultivo), reporta características diferentes a las normales, observándose gónadas atrofiadas, como hilos, con óvulos dispersos y poco visibles. En algunos casos en una misma trucha se observó que una gónada presentaba óvulos, mientras que la otra era un testículo, en contraposición al grupo control en donde los ovarios presentaron las características normales de acuerdo al tiempo de cultivo.
Indice gonadosomático Harbin et al. (1980)
encontraron IGS de 2,3 en truchas maduras del grupo control, mientras
que los peces tratados con 30 mg de metiltestosterona por kg de alimento
presentaron
un IGS de 0,28 cuando habían alcanzado la edad de 2 años. En el presente
trabajo, el IGS de las truchas del grupo experimental presentaron un mayor
valor que el IGS del control a los 17 meses. Las diferencias observadas
entre ese autor y la presente investigación podrían deberse al hecho que
para esa edad las hembras del grupo control se encontraban en etapas tempranas
de desarrollo gonadal, debido a que ellas alcanzan la madurez a los 24
meses de edad, por lo que podemos presumir que para ese momento la mayor
contribución al desarrollo de las gónadas la estaban aportando los machos.
Unido a esta situación, un alto porcentaje de las hembras se había masculinizado
y sus testículos estaban participando de una manera importante en el
valor del IGS.
Pruebas de Progenie A pesar de la baja fertilidad quedaron aproximadamente 300 ejemplares de cada grupo, de los cuales se tomó una muestra de 30 ejemplares por grupo. La progenie procedente de este cruce demostró la efectividad del método utilizado ya que todas las truchas del grupo experimental fueron hembras, mientras que en el grupo control se mantuvo la relación 1:1 (Cuadro 4).
CONCLUSIONES
AGRADECIMIENTOS Los autores agradecen al FONACIT el financiamiento que hizo posible la ejecución del Proyecto BTA-13, del Programa de Nuevas Tecnologías del BID-CONICIT. BIBLIOGRAFÍA
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