Zootecnia Tropical Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas Venezuela ISSN: 0798-7269 Vol. 23, Num. 3, 2005, pp. 259-294

Zootecnia Tropical, Vol. 23, No. 3, 2005, pp. 259-294

Revisión

Metodologías para el estudio de compuestos polifenólicos en especies forrajeras: Un enfoque histórico

Review

Methodologies for the study of polyphenolic compounds in forage species: A historic review

Danny E. García¹ y María G. Medina²

Estación Experimental de Pastos y Forrajes “Indio Hatuey” Central España Republicana, Perico CP 44 280. Matanzas, Cuba

Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas Centro de Investigaciones del estado Trujillo,  Venezuela

Code Number: zt05018

RESUMEN

Mediante la revisión de las publicaciones científicas más representativas sobre la bioquímica de los taninos, se presentan los principales resultados relacionados con sus propiedades beneficiosas y antinutricionales a partir de estudios químico-analíticos, in vitro e in vivo. Se tratan los acápites de mayor relevancia y se describe la repercusión de los conocimientos adquiridos sobre estos compuestos, en el desarrollo de estrategias viables de alimentación. Históricamente, hasta que la química de los productos naturales no se desarrolló cuantitativamente, los estudios de nutrición animal con fuentes forrajeras fenólicas fueron incipientes. Los primeros ensayos realizados con posterioridad a 1950 estuvieron encaminados a la caracterización fitoquímica de las fuentes mayoritarias de taninos y la determinación de la actividad biológica de los principales grupos, haciendo énfasis en las leguminosas forrajeras como recurso suplementario por excelencia. En una segunda etapa se implementaron y validaron las técnicas analíticas que se utilizarían para describir el efecto deletéreo de los polifenoles y su interacción con los metabolitos primarios y secundarios. Se postularon las concentraciones críticas en las cuales estos compuestos podían afectar el buen funcionamiento digestivo de los rumiantes y los monogástricos y se comparó la acción detrimental de los taninos condensados e hidrolizables en diferentes condiciones de alimentación,  determinando las variables de mayor influencia en su acción toxicológica. Independientemente a que las investigaciones realizadas hasta el presente han aportado mucha información en cuanto a las características de los taninos vegetales, en la actualidad existen temas importantes tales como, los mecanismos relacionados con el efecto antihelmíntico, la función ecológica de los taninos hidrolizables en las especies no leguminosas y la interacción de los polifenoles con los alcaloides, entre otros, que no han sido abordados con fuerza; por lo que se precisan estudios integrales para dilucidar estas apremiantes incógnitas.

Palabras clave: Polifenoles, taninos condensados, taninos hidrolizables, factores antinutricionales, alimentación animal.

Summary

By means of the representative scientific publications review on the tannins biochemistry, the main results related to their beneficial and antinutritional properties from chemistry-analytical, in vitro and in vivo studies were presented. The paragraphs are greater relevance and the repercussion of the knowledge acquired on these compounds is described; in the development of viable strategies of feeding.  Historically, until the chemistry of natural products was not developed quantitatively, the animal nutrition studies with phenolic forages sources were insufficient. The first tests made after 1950, were directed to the phytochemical characterization of the majority tannin sources and the determination of the biological activity of the main groups, with particular emphasis in fodder leguminous like additional resource of nutrients.  In one second stage the analytical techniques were implemented and validated that would be used to describe the polyphenols antifeeding effect and its interaction with the primary and secondary metabolites. The critic concentrations, in which these compounds could affect the good digestive process of ruminants and monogastric were postulated. Besides, the detrimental action of tannins hydrolysables and condensed in different conditions of feeding was compared, determining the variables of greater influence in the toxicological action. Independently to that the investigations made until the present have contributed much information as far as the characteristics of vegetal tannins, at the present time exists important subjects such as, the mechanisms related to the antihelmintic effect, the ecological function of hydrolysables tannins in non leguminous species and the interaction of polyphenols with alkaloids; among others, that have not been boarded with force;  reason why integral studies need to explain these urgent questions.

Key words: Polyphenols, condensed tannins, hydrolysable tannins, antinutritional factors, animal feeding.

INTRODUCCIÓN

Consideraciones iniciales

El  tema relacionado con  las implicaciones negativas de los taninos; así como los estudios derivados de sus propiedades bioquímicas son, aún en nuestros días, permanentes. Estas investigaciones son extremadamente polémicas y en muchos casos las conclusiones a las cuales se han arribado muestran incongruencias; por lo que sin lugar a dudas, constituye la especialidad de la fitoquímica aplicada a la nutrición animal de la cual se ha escrito con mayor énfasis en los últimos treinta años.

Dado el elevado número de estudios realizados, los disímiles objetivos trazados por las líneas del pensamiento científico y la contrastante relación estructura/actividad de los principales grupos de taninos, ha sido extremadamente difícil llegar a criterios integradores que ayuden a la comprensión de sus características pro–antinutricionales. El desarrollo paulatino en el conocimiento de los polifenoles de origen vegetal, basados en estudios bioquímicos de nutrición animal, ha sido inconstante. No obstante, en muchas investigaciones se han realizado importantes descubrimientos.

Por tales motivos esta revisión bibliográfica tuvo como objetivo esencial describir el desarrollo evolutivo en los estudios de alimentación con fuentes tánicas, haciendo énfasis solamente en las investigaciones más representativas y que por su contenido, a criterio de los autores, clásicamente han proporcionado aportes sustanciales, cambios de paradigmas en la temática o constituyen etapas significativas en el desarrollo del conocimiento de la actividad biológica de estos importantes metabolitos secundarios.

Historia

Desde épocas remotas los taninos han sido utilizados empíricamente en la conservación de materiales de origen animal por el hecho de "transformar" las pieles en objetos más resistentes y duraderos. Recientemente se ha comprobado que culturas legendarias, tales como la egipcia y la china, empleaban polifenoles naturales para retardar o inactivar la descomposición microbiana de los alimentos y los preparados medicinales y religiosos.

Todas estas evidencias históricas describen la estrecha relación entre el desarrollo de las civilizaciones y la utilización de extractos tánicos como herramienta para su bienestar y desenvolvimiento cotidiano. Los taninos son macromoléculas naturales pertenecientes al grupo de los polifenoles que son sintetizados por numerosas especies vegetales. Estas estructuras se diferencian del resto de los fenoles por presentar elevado peso molecular y precipitar esencialmente las proteínas; debido a la disminución de la solubilidad en el complejo que forma.

Desde comienzos del siglo XX los taninos se convirtieron en el foco de atención de la comunidad científica relacionada con los productos naturales, debido a su amplia distribución en las especies botánicas de mayor valor alimentario para animales y humanos.

El desarrollo de las investigaciones con polifenoles se aceleró sustancialmente por la aparición de la fitoquímica como rama de la química y la evolución en los estudios sistemáticos de clasificación quimiotaxonómicos, los métodos de detección, extracción y purificación de fenoles; así como la implementación del análisis químico orgánico como herramienta fundamental en la dilucidación de estructuras complejas (De Marcano y Hasegawa, 1991).

Si bien hasta el año 1950 solo se contaban con estudios aislados con relación a algunas fuentes naturales de taninos y experimentos de actividad farmocológica, a partir de la segunda mitad del siglo pasado con el desarrollo de la síntesis de los productos naturales, la utilización extensiva de la espectroscopía infrarroja (IR), ultravioleta visible (UV), la resonancia magnética nuclear (RMN) (Willimas y Fleming, 1966; Highet y Sokoloski, 1975), los primeros pasos en la compresión de los procesos de biosíntesis del metabolismo secundario (Bernfeld, 1967) y los métodos cromatográficos (Browning, 1969) las investigaciones bioquímicas con taninos no pasaron a un nivel superior.

A partir de ese momento la literatura científica reúne numerosas informaciones relacionadas con estructuras tánicas pero con un carácter estrictamente orientado hacia la ciencia básica sin describir, de manera aplicada, las implicaciones desde el punto de vista nutricional. En el año 1963 se publicó uno de los primeros trabajos sobre estudios bioquímicos en la evaluación in vitro de forrajes para la alimentación animal (Tilley y Terri, 1963). Esta técnica se empleó posteriormente con mucho éxito en la determinación de la actividad antinutricional de algunos metabolitos polifenólicos.

Principales investigaciones en el siglo XX

Contrariamente a lo que se podría esperar, los taninos hidrolizables (TH) fue el primer grupo de compuestos que se investigó intensivamente. En este sentido Haslam (1965) incursionó en el estudio de los galoil ésteres de la familia Aceraceae y se pretendió cuantificar, mediante métodos analíticos, los contenidos de TH basados en principios estables de reacción con sales inorgánicas. Dichos resultados sirvieron como elementos de partida en el conocimiento de las macromoléculas polifenólicas complejas.

Algunos años después Bate-Smith (1973) profundizó en el estudio de los taninos condensados (TC) presentes en algunas leguminosas como fuentes importantes de forraje, determinando la gran variabilidad interespecífica; así como los principales patrones en el ensayo del nbutanol/HCl/Fe³⁺ como método de cuantificación novedoso en la década. Esta investigación constituyó uno de los primeros trabajos donde se integró armónicamente algunos de los factores que, más adelante, resultaron ser cruciales para la comprensión de las funciones biológicas de los taninos.

En ese mismo período otros resultados relevantes lo constituyeron la utilización del nitrito de sodio (NaNO₂) e Iodato de potasio (KIO₃) para la determinación de elagitaninos basado en la hidrólisis de los ésteres del ácido hexahidroxifénico en presencia de piridina como solvente típico y la determinación de galotaninos y elagitaninos en especies del género Acer  (Bate-Smith, 1977).

Por su parte, Broadhurst y  Jones (1978) utilizaron el método de la Vainillina/HCl para la cuantificación de metadifenoles de manera rutinaria y en ese mismo año Price et al. (1978) realizaron una intensa crítica del protocolo, sustentado en las diferencias de coloración de los monómeros y los polímeros de TC y la sobrestimación de las concentraciones en algunas fuentes forrajeras ricas en flavonoides. Fue la primera ocasión en que se disertó con fuerza sobre las limitaciones de los métodos fitoquímicos para taninos, en la caracterización de las fuentes de alimento animal y sus implicaciones analíticas.

Seguidamente, Hagerman y Butler (1978) emplearon la propiedad biológica por excelencia de los taninos (precipitantes de proteínas) para la estimación de los niveles polifenólicos en la biomasa comestible. Esta constituyó la primera ocasión en que un método químico de cuantificación describía la capacidad astringente de estos compuestos. Un año más tarde, Menke et al. (1979) estimaron la digestibilidad y la energía metabolizable mediante la producción de gas in vitro. Dicho protocolo serviría como procedimiento básico de partida para el acoplamiento con técnicas analíticas que describirían el efecto deletéreo de los taninos de mayor distribución natural.

La década del 80 constituyó el verdadero cambio cualitativo en las investigaciones nutricionales con taninos. En este sentido, Hagerman y Butler (1980) reanudaron los estudios de cuantificación de taninos totales (TT) por el procedimiento de precipitación con la fracción V de la albúmina de suero bovino (BSA) en un considerable número de especies; pero esta vez usando marcaje isotópico con Iodo (¹²⁵I) mediante conteo electromagnético sensible. Esta investigación si bien, fue la primera en emplear los radioisótopos estables para determinar la actividad precipitante de los taninos, no consideraba algunos aspectos medulares de bioseguridad y la implementación del protocolo se encarecía debido a los elevados costos de los reactivos y los equipos.

Seguidamente en 1981 se incursionó en la comprensión de la interacción proteína–tanino, donde los mismos autores estudiaron la regioespecificidad de las uniones macromoleculares de los TC con las estructuras secundarias y terciarias de proteínas séricas químicamente puras (Hagerman y Butler, 1981). Este fue el primer experimento, en condiciones controladas, donde se pudo demostrar que la interacción de los taninos con las moléculas nitrogenadas seguía un patrón estequiométrico racional y que dicha propiedad repercutía fuertemente en la actividad biológica del metabolito; así como en la fisiología digestiva del animal que lo consumía.

Al año siguiente, Butler et al. (1982) lograron modificar el solvente en el ensayo de la Vainillina/HCl para estimar el grado de polimerización de los TC extractables. Sin lugar  a dudas fue la primera vez en que se trató de mejorar un  procedimiento analítico con el propósito de determinar el peso molecular de los taninos y su posible influencia en las propiedades beneficiosas o perjudiciales en el sistema digestivo.

Paralelamente con estos resultados, Orskov (1982) estandalizó el procedimiento para medir los niveles de proteína microbiana remanente en la técnica de digestibilidad in vitro (procesos de liofilización del material); factor de suma importancia en los ensayos de estimación de las propiedades antinutritivas de los taninos.

Dos años más tarde, Larwence et al. (1984) estudiaban el rol de los TC y su implicación en el valor nutritivo de alimentos para animales utilizando polietilenglicol (PEG-4000); compuesto químico que, de manera novedosa, se comenzaba a utilizar en pruebas in vivo con rumiantes por el hecho de presentar una elevada afinidad por los taninos y ser inocuo para los animales en experimentación.

Posteriormente, Reed et al. (1985) explotaron la posibilidad de cuantificar polifenoles totales (PT) en forrajes mediante la precipitación con Acetato de Iterbio tetrahidratado (Yb(AcO)₃ x 4H₂O) por el hecho de no requerir patrones químicos específicos que pudieran traer consigo diferencias numéricas en los análisis por gravimetría clásica. Esta investigación fue la primera en enfocar la necesidad de implementar métodos sencillos y precisos para la cuantificación de un gran número de muestras de forrajes, y tratar de expresar los resultados de diferentes analistas mediante un mismo protocolo experimental. No obstante, en la actualidad, la comparación de los datos provenientes de diferentes autores  continúa siendo una problemática; ya que se siguen empleando métodos analíticos con características disímiles.

En ese año también se estudió la relación de los taninos presentes en la biomasa comestibles, con otros metabolitos secundarios con probada acción anticualitativa (Freeland et al., 1985). En este sentido se demostró que la presencia de saponinas, en algunas fuentes vegetales, abolían el efecto antinutricional de los TC y que la liberación de ácido cianhídrico (HCN), proveniente de los glucósidos cianogénicos, también podía inhibirse con la presencia de TT en determinadas condiciones ecológicas (Goldstein y Spencer, 1985).

Un año después, Barry et al. (1986) comenzaron a dilucidar el papel de los TC en la dieta de los rumiantes, específicamente en la digestión de  los carbohidratos solubles y las proteínas, mediante el acomplejamiento de los polifenoles con PEG–4000. Este experimento demostró que los TC podían también interactuar con los hidratos de carbono y disminuir su utilización efectiva.

Por su parte, Nicholson et al. (1986) esclarecieron, por primera vez, el mecanismo de acción de los taninos clásicos en Colletptrichum graminicola; así como las implicaciones en la patogenicidad del hongo en condiciones naturales de propagación. Este descubrimiento constituyó el primer trabajo en el cual se informó el efecto fungicida de los TC, se conocieron los procesos bioquímicos asociados a dicha actividad y se demostró concisamente que los taninos vegetales presentaban inequívocamente funciones defensiva contra los patógenos foliares en la mayoría de las leguminosas forrajeras.

Conjuntamente, Porter et al. (1986) realizaron pruebas colorimétricas para lograr establecer conversiones analíticas confiables para la cuantificación rutinaria de TC basados en el coeficiente de extinción molar de los monómeros más comunes. Estos cálculos se realizaron ya que, inicialmente la gran diversidad de patrones analíticos para expresar los resultados, proporcionaban lecturas muy contrastantes en los ensayos establecidos de manera previa. La publicación de este método constituye, en la actualidad, una referencia obligada para aquellos investigadores que incursionan en la determinación de TC en alimentos para animales y humanos.

Independientemente se desarrolló un procedimiento espectro-fotométrico para la cuantificación de purinas como marcadores importantes de la relación masa microbiana/proteína, como complemento de la cromatografía de alta resolución (HPLC) para la estimación de la actividad biológica de los TC  (Zinn y Owens, 1986).

En 1987 se continuaron los estudios sobre la capacidad  de precipitación de los taninos; pero haciendo énfasis en la cantidad de proteína precipitada por unidad de fenol (g BSA/g PT) como criterio cuantitativo relevante (Makkar et al., 1987). Esta técnica se basó en algunas modificaciones realizadas con anterioridad, y su mayor novedad radicó en que la proteína de prueba se solubilizaba en una solución detergente (SDS) y posterior se cuantificaba con un reactivo específico y sensible (Ninhidrina). Los resultados que derivaron del ensayo ayudaron a comprender, en su momento, que  los taninos de una misma subfamilia química, con características estructurales muy similares, podían reaccionar de manera extremadamente disímil con los mismos analíticos. De esta manera se pudo establecer que la relación g BSA/g PT era el indicador más viable para describir la afinidad particular de cada tanino, y que a su vez correlacionaba fuertemente con las propiedades  deletéreas de estos compuestos.

Como transformación al procedimiento anterior, pero sustentado en el mismo principio del método, Hagerman (1987) desarrolló el protocolo de la difusión radial en fase sólida. Mediante la técnica se obtenían resultados similares a las cuantificaciones realizadas en  medio líquido, solo que se necesitaba un gel de agarosa y algunos materiales adicionales. Por otra parte se prescindía de un instrumento costoso y no siempre accesible en todos los laboratorios (espectrofotómetro UV). Este método sirvió como complemento en la comprobación de las propiedades químico–físicas de los taninos y moduló, desde el punto de vista biológico, las propiedades astringentes de los TC en monogástricos y rumiantes.

Así mismo, Price et al. (1987) obtuvieron avances importantes en el conocimiento de los efectos conjugados de las saponinas con los TT en la absorción intestinal, y se comprobó lo dañino que podían resultar las concentraciones elevadas de TC y TH en los órganos internos del ganado. Esta investigación ayudó a establecer las semejanzas y diferencias existentes en la acción detrimental de los grupos de taninos y su tiempo de vida media en los animales en condiciones in vivo; factores que no han sido retomados con posterioridad en las investigaciones de fisiología digestiva y que presenta una vital importancia en la comprensión de la relación beneficio/riesgo en la alimentación con fuentes taníferas.

Por su parte, Mueller-Harvey et al. (1987) emplearon exitosamente la cromatografía de capa delgada (TLC) para caracterizar las particularidades estructurales de los PT, TC y TH mediante la combinación de reactivos cualitativos selectivos en las leguminosas. Fue la primera ocasión en que, mediante la combinación del HPLC y un procedimiento sencillo, se pudo determinar las diferencias fitoquímicas existentes entre especies con características similares.

El año 1988 fue el más prolífero en cuanto a aportes sustanciales en las pruebas bioquímicas con taninos. Al respecto, se extendió el método microcuantitativo de determinación de la capacidad precipitante a condiciones rutinarias (Dawra et al., 1988). Inoue y Hagerman (1988) modificaron un procedimiento para la determinación de TH mediante el desarrollo de color con Rodanina. También se obtuvo la primera dinámica microbiológica ruminal asociada a concentraciones variable de TH  y se llevó a cabo el estudio más integral en la época sobre la variabilidad en los niveles de TC y TH, el grado de polimerización y su estrecha relación con la capacidad de precipitación de proteínas (Makkar et al., 1988a,b). Esta investigación estableció que, para lograr establecer de manera integral la verdadera acción detrimental de los taninos, los estudios no podían centrarse solamente en la cuantificación de sus concentraciones, y que necesariamente se requerían estudios en los cuales se determinara la interacción polifenol-microorganismo, la naturaleza de los compuestos acompañantes, las particularidades macroestructurales y los resultados  de los bioensayos de simulación.

Un hecho singular lo constituyó el descubrimiento del nexo entre la concentración de los taninos con el incremento de la madurez de la biomasa en Quersus incana; una leguminosa templada con probado potencial forrajero (Makkar et al., 1988a). En dicha investigación se logró demostrar que los niveles de TT no permanecían estáticos en la fitomasa y que a su vez, las concentraciones se encontraban relacionadas negativamente con los procesos naturales de senescencia. En el estudio se llegó a la conclusión de que al aumentar la edad de las hojas, los TC presentes aumentan el grado de polimerización y, por ende, disminuyen sus propiedades antinutricionales.

Posteriormente, Makkar et al. (1989) relacionaron los parámetros de degradabilidad ruminal y los niveles de fibra  con los contenidos de taninos en especies de interés alimentario, llegando a la conclusión que los polifenoles de la fracción fibrosa (ligninas) también presentaban una importante significación biológica en la interacción con los animales herbívoros. Por otro lado, se publicó la reseña más completa sobre los métodos químicos de precipitación de proteínas, en la cual se describieron todas las ventajas y limitaciones de las técnicas para la determinación de TC; así como sus implicaciones en la biología nutricional (Makkar, 1989). Estos dos últimos trabajos dieron a conocer, de forma precisa, los efectos detrimentales más comunes de los TC y las particularidades de los métodos, elementos esenciales que no estaban totalmente esclarecidos hasta ese momento.

En la última década del siglo pasado se realizaron los mayores aportes en el campo de la bioquímica nutricional con taninos. En ese sentido, se inició un creciente interés no solo a los niveles y a las características más determinantes de los taninos provenientes de las especies forrajeras típicas; sino también a los contenidos de los polifenoles presentes en los subproductos agroindustriales como una considerable fuente de material voluminoso para los rumiantes (Makkar et al., 1990).

Por su parte, Lowry y Sumpter (1990) criticaron el método gravimétrico para la determinación de PT con Yb³⁺ debido a que el catión no reaccionaba cuantitativamente con algunos flavonoides (Rutina) y era inefectivo en especies con bajos contenidos de fenoles.

Makkar et al. (1991) publicaron el artículo más completo sobre los TT presentes en las especies del género Quersus; así como su relación con la edad del rebrote. Fue la segunda ocasión en que los autores postularon que, en sentido general, la edad en que las especies forrajeras presentaban un mejor valor nutritivo (máximos niveles de PC y mínima fracción fibrosa) contradictoriamente poseen los mayores contenidos de  PT y TC.

Asimismo, Peng et al. (1991) describieron la insolubilidad de algunos elagitaninos (TH) presentes en la madera de plantas forrajeras, lo que sugirió la posibilidad de que no solo los TC pudieran estar unidos a los constituyentes de la pared celular de los vegetales. Desde ese año, en la literatura científica, no se ha publicado otra evidencia similar sobre la probable presencia de TH no extractables en los forrajes tropicales.

Más adelante, Makkar y Singh (1991) determinaron la concentración de los TC en la hojarasca y el material verde de la región aérea de plantas autóctonas. Este experimento demostró que el proceso de caída de las hojas los taninos se acumulan, mediante reacciones enzimáticas, en la fracción de carbohidratos insolubles (FF) y que los procesos de envejecimiento natural de la biomasa, afectaban drásticamente los contenidos de las estructuras fenólicas. Dicho fenómeno había sido descrito, dos años antes, en las especies Calliandra calorphyrsus y Gliricidia sepium en las cuales, mediante pruebas de laboratorio, se indujo la deshidratación artificial (Ahn et al., 1997). También en esa etapa, Fish y Thompson (1991) describieron la interacción lectina-tanino como un complejo capaz de eliminar la acción detrimental de los polifenoles frente a la enzima L-amilasa en un experimento in vitro, demostrando que uno de los metabolitos secundarios de mayor actividad tóxica también podía presentar efectos positivos en la ecología digestiva.

En 1992 se publicaron numerosas investigaciones que aportaron una nueva visión sobre la importancia de los taninos y el desarrollo de técnicas colaterales para la estimación del valor nutritivo en alimentos para rumiantes. Al respecto, se optimizaron técnicas para la liofilización microbiana y la determinación simultánea de purinas en algunos bioensayos de acoplamiento (Yanh y Russell, 1992; Balcells et al., 1992).

En otro orden, se profundizó en las características y la función de los TC en especies forrajeras del género Acacia; empleada ampliamente como modelo fitoquímico típico de las regiones áridas (Pritchard et al., 1992), así como tres de las primeras investigaciones sobre la detoxificación de taninos (Makkar y Sing, 1992 a,b,c). Un resultado singular lo constituyó la predicción realizada por Hanley et al. (1992) sobre la digestibilidad de la PC y la MS con los niveles variantes de TC  cuantificados por el método de la BSA. En este sentido, fue la primera vez en que se usaron modelos matemáticos específicos para generar ecuaciones aplicables a diferentes condiciones de alimentación.

Otro hecho singular resultó el reporte sobre la toxicidad aguda de los TH en los rumiantes, y los estudios de regionalización realizados por Garg et al. (1992). Mediante este último estudio se comprendió que no solo los TC podían ocasionar daños irreversibles en la ecología ruminal; sino que la hidrólisis de los TH podrían traer consigo también incidencias negativas en los animales poligástricos.

Con relación a los métodos de cuantificación, Terrill et al. (1992) desarrollaron un procedimiento colateral muy útil para la determinación de TC unidos a la PC y a los componentes fibrosos con solventes específicos. No obstante, el coeficiente de variación de los resultados mediante la metodología dependía, en buena medida, de la matriz analítica ensayada y se necesitaba obligatoriamente campanas de extracción de gases debido a los olores desagradables de los componentes azufrados. Seguidamente, Mueller-Harvey y McAllan (1992) publicaron una reseña integral sobre las implicaciones nutricionales en la alimentación de los monogástricos y los rumiantes con fuentes tánicas, realizando un análisis exhaustivo sobre los protocolos más comunes de aplicación.

Por otra parte, Caygil y Mueller-Harvey (1999) disertaron sobre el efecto de  factores de manejos tales como la fertilización y la edad de la planta, en los contenidos de PT y TC en algunas leguminosas templadas, además de referirse  a la teoría de balance carbono-nitrógeno como principal hipótesis para explicar las transformaciones endógenas de los taninos. El principal logro de la investigación radicó en que, basado en los conocimientos clásicos sobre la biosíntesis de los metabolitos secundarios, se discutió sobre la relación directa de los compuestos nitrogenados de las especies vegetales con las rutas químicas derivadas del ácido shikímico como molécula precursora de todos las estructuras fenólicas.

En tanto, Makkar et al. (1993) correlacionaron los resultados de las cuantificaciones  de TC entre los dos métodos analíticos más utilizados en los laboratorios de evaluación de alimentos (precipitación con polivinil polipirrolidona (PVPP) y con BSA); Makkar y Becker (1993a) estudiaron las posibles variantes de extracción en el procedimiento de la vainillina/HCl; se investigó sobre la inclusión de aditivos químicos (urea) y su efecto en  el valor nutritivo de los forrajes con elevadas cantidades de TC (Makkar y Singh, 1993) y por último, se presentaron los resultados más novedosos sobre la variabilidad estructural de los TH con la fuente comercial (Makkar y Becker, 1993b).

Después de haber publicado una gran cantidad de investigaciones sobre la cuantificación de metabolitos fenólicos, Makkar y Becker (1994a) señalaron las principales limitaciones y logros de los ensayos de cuantificación de taninos, planteando estrategias viables de solución para los procedimientos que presentaban limitaciones prácticas. En ese sentido, los autores también describieron las etapas más importantes para el aislamiento de TC a partir de forrajes, que pudieran ser empleados como patrones para la realización de las curvas de calibración en los métodos fotométricos (Makkar y Becker, 1994b). Por otra parte se probó definitivamente que los TC no difundía hacia el torrente sanguíneo en el caso de los monogástricos (Terrill et al., 1994); demostrando así que no ocurría la adsorción estomacal e intestinal en ninguno de los casos.

Más adelante, McAllister et al. (1994)  comenzaron los estudios sobre la interacción de los TC con los microorganismos del rumen (Fibrobacter succinogens); demostrando el efecto inhibidor de los taninos sobre dichos organismos y Makkar et al. (1994) demostraron que algunos taninos, de amplia distribución taxonómica, eran también degradados cuantitativamente por microorganismos comunes.

Se comenzó a profundizar sobre el perfil polifenólico de Lotus pedunculatus y Lotus corniculatus (forrajes de elevada distribución subtropical) y su repercusión en la fracción no nitrogenada y el metabolismo del plasma en ovinos; respectivamente (Waghorn et al., 1994; Waghorn y Shelton, 1997). Estas leguminosas templadas sirvieron de modelo para las investigaciones en plantas tropicales, en etapas posteriores de investigación y  se comenzaron a establecer, preliminarmente, límites críticos de TC en los cuales los metabolitos no causaban trastornos digestivos en los rumiantes.

Adicionalmente, Terrill et al. (1994) comenzaron a realizar estudios de digestión con carbono radiactivo (¹⁴C). Estas pruebas fueron las primeras en concluir que los TC presentan adsorción post-ruminal y que su paso al torrente sanguíneo era poco probable. El experimento ayudó a comprender que la acción antinutricional de los TC en los rumiantes ocurre, esencialmente, por la inactivación enzimática y el desequilibrio poblacional de los organismos ruminales y no por desórdenes en el metabolismo sanguíneo.

Sobre esta problemática, pero en el caso de monogástricos, Jansman et al. (1994) descubrieron mecanismos de adaptación (secreción de la glándula parótidas) cuando se suministraban a las ratas dietas con elevados contenidos de taninos; demostrando que no solo los rumiantes son capaces de responder fisiológicamente ante la inclusión de fenoles tóxicos por vía oral.

Posteriormente, Makkar et al. (1995) describían los principales problemas en la determinación de la fracción fibrosa de los forrajes ricos en TC. También realizaron una valoración sobre las implicaciones de esta limitante en la determinación de parámetros digestivos, las fuentes más comunes de error; así como la validez de los resultados en estudios in vitro.

Por otra parte, se llevó a cabo uno de los primeros experimentos integradores en el cual, bajo condiciones controladas, se determinó el efecto de algunas variables del ecosistema ruminal  y las estructuras químicas de  los taninos en la formación del complejo tanino-proteína. (Pérez-Maldonado et al., 1995).

Otro hecho significativo lo constituyó la comparación entre las reacciones del PEG-4000 y la PVPP con los taninos (Makkar et al., 1995a). Estos resultados fueron utilizados con posterioridad en el mejoramiento de los métodos analíticos para la determinación del efecto negativo y la separación cuantitativa de los TC; respectivamente.

Asimismo, se aisló y caracterizó la primera bacteria capaz de degradar los TH, resultado que tuvo mucho impacto en la comunidad científica; ya que hasta ese momento todos los esfuerzos investigativos habían estado centrados en la búsqueda de microorganismos capaces de metabolizar TC (Nelson et al., 1995). También se comenzó a utilizar intensivamente la técnica de simulación ruminal (RUSITEC) con la que se pudo comprobar el efecto antinutricional de varias fuentes de alimento para rumiantes; así como la modulación de la interacción tanino-saponina mediante el ensayo de producción de gases (Makkar et al., 1995; Makkar et al., 1995b). Con estos estudios se logró comprobar que las saponinas, clásicamente identificadas como compuestos antinutricionales, también podrían presentar efectos positivos al combinarse con los polifenoles.

A partir de la investigación realizada por Degen et al. (1995), se le dio otra connotación a las leguminosas con elevados contenidos de taninos, pero esta vez como alimento principal en zonas con climas áridos y pobreza extrema. Posteriormente se publicó un trabajo sobre las implicaciones ecológicas de los taninos en el medio natural (Ruohomaki et al., 1996) y el material más completo del quinquenio sobre los bioensayos con fenoles (Makkar y Becker, 1996).

Por su parte, Silanikova et al. (1996) y Silanikova et al. (1996) publicaron unos interesantes trabajos sobre la inclusión de PEG-4000 en pruebas metabólicas integrales con diversas alternativas de alimentación, llegando a la conclusión que no todas las fuentes polifenólicas ocasionaban los mismos efectos.

En otro orden de investigación, se estableció la necesidad de cuantificar indistintamente los contenidos de PT, TT, TC y TH como indicadores imprescindibles en la evaluación y selección de alimentos para animales tales como subproductos agroindustriales, forrajes convencionales y alternativos (Lamers et al., 1996; Makkar et al., 1996; Stienezen et al., 1996). De igual manera, se investigó sobre las propiedades beneficiosas de los taninos mediante estudios de inhibición de biomarcadores de tumores cutáneos (Perchellet et al., 1996) y se comenzó a utilizar la RMN-¹³C en el estudio de la degradación biológica de los taninos por hongos (Gamble et al., 1996).

Otros resultados relevantes lo constituyó la determinación de los efectos  de los TC en el pastoreo con especies leguminosas (Wang et al. 1996), el efecto en la digestión de los carbohidratos en bovinos y caprinos (Pérez-Maldonado y Norton, 1996), la posibilidad de degradación del complejo tanino-proteína por algunos microorganismos ruminales y la determinación de las especificidades en la interacción tanino-saponina  (Bhat et al., 1996).

En 1997 se reanudaron las pruebas con PEG-4000 y  TC en ensayos in vivo (Ben Salem et al., 1997a,b), se disertó sobre los métodos cuantitativos de TC y TH con la misma importancia y profundización (Hagerman et al., 1997) y se estimaron los contenidos de TC mediante la reacción con agentes químicos específicos (Matthews et al., 1997). En esta investigación, mediante los estudios de los mecanismos en la sustitución electrofílica, los taninos con elevado peso molecular podían cuantificarse después de sus rupturas poliméricas.

Por otra parte, se comenzó a utilizar el espectro IR cercano (NIR) para la cuantificación de TC a frecuencias muy específicas  (2 150 cm^-1) (Goodchild et al., 1997) y Makkar et al. (1997) profundizaron en las relaciones fisiológicas entre la fracción polifenólica y otros metabolitos secundarios (saponinas y fitatos) con parámetros de valor nutritivo usando correlaciones para determinar la función ecológica en variedades de leguminosas.

Aunque ambos resultados constituyeron grandes avances en el entendimiento de la biología de los taninos, el empleo de ondas electromagnéticas largas y las correlaciones inter-metabólicas no han sido retomadas intensivamente en el siglo XXI.

Con relación a recopilaciones bibliográficas, Makkar et al. (1997a) publicaron el primer tratado sobre la técnica de producción de gas in vitro y su acoplamiento con las determinaciones de los taninos, como vía para la comprensión de su efecto detrimental. También, Makkar et al. (1997b)  informaron que existían diferencias sustanciales entre la digestibilidad aparente y la verdadera cuando los forrajes contenían elevados niveles de taninos.

Por su parte, Makkar y Becker (1997a,b) demostraron que las proteínas ricas en el aminoácido Prolina constituyen las primeras líneas de defensa contra los taninos, en los ovinos alimentados con elevadas dosis de estos metabolitos y que los TC no extractables presentaban poca repercusión antinutricional, respectivamente. En tanto, Miller et al. (1997) comprobaron la posibilidad de obtener inóculos detanificantes a partir de rumiantes. Este resultado puso de manifiesto que, mediante manipulación biotecnológica, se podría obtener cultivos de microorganismos selectivos capaces de degradar compuestos anticualitativos en determinadas condiciones de producción. Un año después se discutió sobre las ventajas y limitaciones en el uso de técnicas in vitro para la estimación biológica de la actividad de los TC (Makkar et al., 1998) y que, en todos los casos, no era evidente su acción antinutricional (Chiquette et al., 1998).

Se publicaron investigaciones relacionadas con la significación nutricional de los TC unidos a la FF (TC-FF) y se comprobó principalmente que estos compuestos no extractables no presentan implicaciones nutricionales negativas (Getachew et al., 1998). Mediante estudios de regionalización se demostró que las plantas adaptadas a condiciones estresantes de clima y suelo presentan mayor concentración de PT y  actividad precipitante (Makkar y Becker, 1998); criterios que enfatizaron la función defensiva de los fenoles cuando las condiciones edafoclimáticas son adversas para las plantas. Adicionalmente, McSweeney et al. (1998) profundizaron en el conocimiento del efecto deletéreo conjugado de los TH en el valor nutritivo de otras leguminosas de uso común en el trópico.

Resumiendo algunos de los principales efectos de los taninos en la interacción con los animales herbívoros, los Cuadros 1a y 1b muestran la incidencia de los polifenoles de diversas especies forrajeras en los sistemas biológicos. 

En el mismo período se sugirieron valores de PC, TC y TH en las cuales las especies forrajeras podrían compararse en cuanto a su composición química (Aregheore et al., 1998) estableciéndose así indicadores que describieran la calidad de cada fuente de alimento.

Adicionalmente se estudió la variabilidad en las concentraciones de los TC en especies de un mismo género, demostrando que las posibles variaciones en los patrones isoenzimáticos repercutían claramente en las rutas biosintéticas de los TC (McNeill et al., 1998). 

Se realizó un extenso trabajo de clasificación fenotípica sobre las bacterias ruminales tolerantes a elevadas dosis de taninos (Nelson et al., 1998) y se realizó la primera investigación en la cual, mediante técnicas biotecnológicas, se pudo comparar el efecto de los niveles contratantes de TC provenientes de un mismo forraje en parámetros digestivos.

Se mejoró la metodología para la cuantificación de TH con  KIO₃  y se dilucidaron los mecanismos de precipitación de proteínas con los galotaninos y la epicatequina 4→8 (Willis y Allen, 1998; Hagerman et al., 1998). Estos resultados demostraron que los TH como compuestos que estructuralmente no se formaban por condensaciones de flavonoides; sino mediante el acoplamiento de anillos de carbohidratos y fenoles simples, precipitaban igualmente las proteínas de las soluciones acuosas.

La última década del siglo XX constituyó la etapa cumbre en los estudios nutricionales con taninos. En este sentido se demostró, utilizando RMN, que mediante la estrategia de extracción de los TC-FF por el método del nbutanol/HCl/Fe³⁺ no todos los TC se hidrolizaban cuantitativamente a partir de la fracción fibrosa (Makkar et al., 1999). Esta investigación describió lo difícil que resulta el diseño de procedimientos analíticos que no presenten limitaciones prácticas en algunas de sus etapas. Se comenzaron a emplear los métodos que inicialmente habían sido diseñados para la  cuantificación de tóxicos en alimentos para animales, en el control de la calidad de alimentos para humanos; lo que trajo consigo un aumento en la rigurosidad de los controles para los concentrados comerciales (Labarbe et al., 1999).

Por su parte, Naurato et al. (1999) realizaron estudios sobre la interacción tanino-histatina (proteína de origen humano) demostrando patrones de acoplamientos similares a los ya conocidos en el caso de los roedores y los rumiantes. También se realizaron investigaciones paralelas con ratas y ovejas demostrando la existencia de cambios drásticos en el tejido y la utilización de los nutrientes por elevadas concentraciones de TC (Dawson et al., 1999). Este experimento demostró que la acción detrimental de los polifenoles resulta común para todas las variantes de los sistemas digestivos.

Un logró sustancial lo constituyeron los primeros ensayos microbiológicos  sobre la modulación de la ecología ruminal en animales alimentados con dietas con  elevados niveles de TC, demostrando que el sistema microbiano-ruminal se adaptaba progresivamente para poder realizar un uso adecuado de las fuentes de nutrimentos (Odenyo et al., 1999). Dichos resultados orientaron las investigaciones al estudio de las interacciones microbianas como clave imprescindibles en la comprensión de la acción de los taninos en los animales poligástricos.

Por otra parte, se comenzaron las investigaciones sobre el papel de los TC en los procesos de conservación de forrajes y se concluyó una etapa importante en las investigaciones con Acacia cyanophylla (Ben Salem et al., 1999a,b). Con relación a eso, Hagerman et al. (1999) resaltaron la importancia de los taninos en el control de la proteína soluble de los ensilajes, así como su repercusión en el mejor aprovechamiento de los efluentes producidos por la fermentación microbiana.

Finalmente, Makkar y Becker (1999) optimizaron la cuantificación de algunas bases nitrogenadas, en los bioensayos con taninos, mediante la utilización de la HPLC, con el propósito de estimar parámetros relacionados con su acción detrimental.

Investigaciones  en los inicios del siglo XXI

En el nuevo milenio las investigaciones con PEG-4000 aportaron más información sobre el efecto de los TC en cuanto a la velocidad de producción de proteína microbiana, su relación con el nitrógeno endógeno y el metabolismo proteico en rumiantes con diversas fuentes tánicas (Getachew et al., 2000a; McNeil et al., 2000, Ben Salem et al., 2000). Dichas investigaciones consolidaron los conocimientos adquiridos, en décadas anteriores, sobre el efecto de los taninos en la producción animal en diferentes partes del mundo.

Por su parte, Jones et al. (2000) promulgaron la selección de especies forrajeras teniendo en cuenta las propiedades positivas de los taninos así como sus características antinutricionales. Fue la primera ocasión en que los métodos de selección le confirieron importancia a la acción pronutricional de los taninos como una propiedad determinante.

Se estudió también la estequiometría en la producción de ácidos grasos volátiles en sistema in vitro con taninos (Getachew et al., 2002); así como la producción de gas en sistema isoproteicos y variantes de nitrógeno (Getachew et al., 2000b). Estos mismos autores en investigaciones posteriores caracterizaron la cinética de fermentación y algunos parámetros de desarrollo microbiano en presencia de  polifenoles conocidos (Getachew et al., 2000c).

Con  relación a estudios microbiológicos,  Pell et al. (2000) probaron la tolerancia microbiana en diferentes especies de rumiantes con contenidos variables de taninos; así como los mecanismos probables para resistir la detoxificación (Brooker et al., 2000). Estos estudios señalaron que ni los contenidos más elevados de TC resultaban letales si previamente los animales se adaptaban a consumir dietas con niveles crecientes de polifenoles.

En otro orden de investigaciones, se comenzó a promocionar la factibilidad de la inclusión en las dietas para humanos de macromoléculas fenólicas como mejoradoras de la salud (King, 2000) y se demostró que en determinados géneros de leguminosas, independientemente de la variabilidad cuantitativa con relación a los taninos, el patrón de actividad biológica se repetía claramente (Palmer y McSweeney, 2000).

Por otra parte, se publicó uno de los estudios más sólidos sobre el efecto antihelmíntico de los TC en rumiantes (Kahn y Díaz-Hernández, 2000), aunque en ninguna investigación relacionada con la temática se ha podido describir el mecanismo por el cual el conteo fecal de huevos (hpg) y la población de parásitos adultos en el tracto gastrointestinal disminuyen de manera abrupta.

En el año 2001 se publicaron las dos reseñas más completas sobre el desarrollo  en las técnicas de cuantificación de TH (Mueller-Harvey, 2001) y TC (Schofield et al., 2001); así como el empleo extensivo de la tiólisis para el análisis por HPLC de alimentos para humanos (Guyot et al., 2001) y la metanólisis en el caso de los TH  (Lei et al., 2001). Adicionalmente se estudió el efecto pos-ingestivo de los TC y las saponinas en mediciones con PEG-4000 (Silanikova et al., 2001), se describió exhaustivamente la interacción tanino-microorganismo desde el punto de vista biológico (McSweeney et al., 2001) y se profundizó en el conocimiento de los procesos de degradación de los TC en el sistema digestivo de los animales monogástricos (Abia y Fry, 2001). 

Un año más tarde, Hoffmann et al. (2002) realizaron la modificación más importante en la optimización de los ensayos biológicos de la capacidad precipitante de los taninos y Hartzfeld et al. (2002) prosiguieron con las cuantificaciones selectivas de TH con sales inorgánicas. Posteriormente, Henson et al. (2003) modificaron esta vez el procedimiento de la BSA con ¹²⁵I, mediante conteo gamma, para eliminar el procedimiento de la centrifugación y la manipulación del material radioactivo, aspectos que constituían una deficiencia de la técnica desde sus comienzos.

Finalmente, Makkar (2003), basado en los procedimientos establecidos por la Organización Internacional de Energía Atómica, publicó la guía más completa en el análisis químico de fenoles en los árboles y arbustos con potencial forrajero. Sin lugar a dudas, este material constituye la recopilación de 30 años de investigaciones intensivas en la búsqueda de procedimientos analíticos para la comprensión de la bioquímica de las macromoléculas polifenólicas.

Consideraciones finales

Si bien es cierto que el gran número de investigaciones con taninos han permitido conocer muchos aspectos de su naturaleza, función e importancia, todavía en el primer quinquenio del nuevo siglo prevalecen muchas incógnitas que no han sido respondidas.

En este sentido, el Cuadro 2 muestra las temáticas más abordadas mundialmente, así como los acápites en los cuales se debe investigar con mayor énfasis para dilucidar algunos aspectos de vital importancia.

CONCLUSIONES

En la segunda mitad del siglo XX y los primeros años del nuevo milenio se han llevado a cabo la mayor cantidad de estudios con taninos, debido fundamentalmente a que diversas líneas de investigación relacionadas con la  alimentación animal y humana, la ciencia de los materiales, la farmacología, la cosmética y la medicina han descubierto, a partir de sus propiedades singulares,  numerosos usos y beneficios.

El interés creciente en la comprensión de sus características pro-nutricionales/tóxicas ha derivado de la búsqueda de nuevos alimentos suplementarios para el ganado, fundamentalmente leguminosas tropicales y templadas como alternativas viables por su excelente composición química y elevado valor nutritivo; comparado con las gramíneas de pastoreo. Estos estudios básicos, realizados en la mayoría de los casos con especies  y animales adaptados a condiciones subtropicales, han aportado conocimientos prácticos para poder realizar un manejo más eficiente de los alimentos que, por naturaleza, presentan considerables niveles de taninos.

La mayoría de las investigaciones de bioquímica nutricional y fisiología digestiva con fuentes tánicas se han llevado a cabo en países desarrollados, donde la disponibilidad de recursos e instrumentación  no constituyen limitantes en los laboratorios de evaluación de alimentos. No obstante, en Latinoamérica se deben continuar los ensayos para aclarar, fundamentalmente, las propiedades beneficiosas de los taninos en la nutrición animal, determinar las características antinutricionales de los polifenoles presentes en las leguminosas de mayor distribución en el área y formular estrategias viables para aumentar la productividad ganadera basada en estas fuentes de alimentos.

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