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Zootecnia Tropical, Vol. 26, No. 3, 2008, pp. 249-252 Efecto modulador de Leucaena leucocephala sobre la microbiota ruminal Modulator effect of Leucaena leucocephala on the rumen microbiota Juana Galindo*, Niurca González, Denia Delgado, Areadne Sosa, Yoandra Marrero, Rogelio González, Ana I. Aldana y Onidia Moreira Instituto de Ciencia Animal, La Habana, Cuba. *Correo electrónico: jgalindo@ica.co.cu Code Number: zt08039 RESUMEN Con el objetivo de evaluar el efecto modulador de Leucaena leucocephala en la población de bacterias metanogénicas y otros grupos microbianos del rumen, se condujo un experimento bajo un diseño completamente aleatorizado en arreglo factorial (4 x 4, cuatro proporciones de leucaena y cuatro tiempos de fermentación) en condiciones in vitro. Los tratamientos consistieron en cuatro relaciones de pasto estrella (Cynodon nlenfuensis) con leucaena, los cuales fueron: Tratamiento A=100:0, B=80:20, C=75:25 y D=70:30. Los muestreos se efectuaron antes de incubar (hora 0), a las 4, 8 y 12 h, después de iniciada la fermentación. Los conteos de bacterias metanogénicas fueron 40,22 38,42 13,98 y 12,46 x 107 ufc/mL para los tratamientos A, B, C y D, respectivamente. El modulador incrementó la población de bacterias celulolíticas en relación al tratamiento control sin suplementar y la mejor respuesta se encontró con las relaciones 80:20 y 70:30. Las poblaciones de hongos celulolíticos fueron 2,08 3,49 3,69 y 4,48 x 105 uft/mL para los tratamientos A, B. C y D, respectivamente. La población de protozoarios estuvo entre 1,50 a 2,75 x 105 células/mL bajo las condiciones experimentales desarrolladas. En todos los tratamientos con L. leucocephala, las poblaciones fueron significativamente más bajas, observándose la menor población para la relación 80:20. Se concluye que Leucaena leucocephala al 25% de la dieta es adecuada para reducir la población de bacterias metanogénicas ruminales sin comprometer la población total de bacterias celulolíticas. Palabras clave: rumen, metanógenos bacterias celulolíticas, hongos, modulador ABSTRACT With the objective to evaluate the modulator effect of Leucaena leucocephala on the methanogenic bacteria and other microbial groups in the rumen was conducted a trial according to a completely randomized design in a factorial arrangement (4 x 4, four leucaena proportions and four times of fermentation), under in vitro conditions. The trial consisted of four star grass (Cynodon nlemfuensis) with leucaena ratios, which were: treatment A=100:0, B=80:20, C=75:25, and D=70:30. The sampling was performed before the incubation (0 hour), and at 4, 8, and 12 h of fermentation. The counts of methanogenic bacteria were 40.22, 38.42, 13.98, and 12.46 x 107 cfu/mL for the treatments A, B, C, and D, respectively. The modulator increased the population of cellulolytic bacteria, compared with the control without supplement, and the best response was found in the ratios 80:20 and 70:30. The populations of cellulolytic fungi were 2.08, 3.49, 3.69, and 4.48 x 103 tfu/mL for A, B, C, and D treatments, respectively. The protoozoa population varied from 1.50 to 2.75 x 105 cell/mL, under the trial conditions. In all cases with L. leucocephala as modulator the populations were significantly small, but the smallest was found when the ratio 80:20 of star grass:modulator was used. It is concluded that the modulator from the fermentation with L. leucocephala is suitable for reducing the population of rumen methanogenic bacteria without affecting the total population of cellulolytic bacteria. Keywords: rumen, methanogenic, cellulolytic bacteria, fungi, modulator. INTRODUCCIÓN Leucaena leucocephala es una de las leguminosas más utilizadas en Cuba debido a su alto contenido en proteínas, minerales y vitaminas. Trabajos recientes desarrollados en el Instituto de Ciencia Animal destacan el contenido en polifenoles totales (5,84%) y taninos condensados totales (1,8 a 4%). La inclusión de L. leucocephala en la dieta de los animales activa el crecimiento de las microorganismos celulolíticos del rumen, tanto bacterias como hongos. Los metabolitos secundarios presentes en esta especie actúan como agentes desfaunantes del órgano. Esto pudiera tener influencia en la ecología ruminal debido a que los metanógenos se adhieren directamente a los protozoos y cohabitan simbióticamente, lo que facilita la transferencia de H2 entre especies La producción de metano por los rumiantes tiene un impacto ambiental debido a que ese gas es uno de los que más contribuye al efecto invernadero al ser responsable del 18% de este fenómeno (Beauchemin y McGinn, 2005), además de representar una gran pérdida de la energía del alimento, lo que trae como consecuencia disminución en la productividad de estos animales Por los aspectos anteriormente mencionados, el objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto modulador in vitro de la inclusión de Leucaena leucocephala sobre la microbiota del rumen MATERIALES Y MÉTODOS Tratamientos experimentales Se evaluaron cuatro tratamientos según un diseño completamente aleatorizado en arreglo factorial (4 x 4, cuatro niveles de inclusión de leucaena y cuatro tiempos de fermentación in vitro). Los tratamientos experimentales se determinaron a partir de la inclusión de cuatro relaciones relaciones de pasto estrella (Cynodon nlenfuensis) con Leucaena leucocephala, como modulador, las cuales fueron: A) 100:0, B) 80:20, C) 75:25 y D) 70:30. La composición química del pasto estrella fue 7,26 74,57, 10,11, 0,42 y 0,18% de PB, FDN, ceniza, calcio y fósforo, respectivamente, mientras que leucaena obtuvo valores 26,45 47,37 12,01 1,45 y 0,30% de PB, FDN, ceniza, calcio y fósforo, respectivamente (AOAC, 1994). Procedimiento experimental El experimento se condujo bajo condiciones in vitro, para lo cual se utilizó la técnica de Theodorou et al. (1994), donde se emplearon botellas de 100 mL selladas para incubar las muestras de alimento en líquido ruminal y un medio buffer. El inoculo ruminal se obtuvo a partir de tres toros mestizos estabulados y canulados en rumen, alimentados con una dieta de forraje de pasto estrella, sin suplementación adicional y libre acceso al agua. Para conformar la mezcla a fermentar, se utilizó el pool de líquido ruminal de los tres toros con el propósito de eliminar el efecto animal. Los muestreos se efectuaron antes de incubar (hora 0), a las 4, 8 y 12 h después de iniciada la fermentación. Se replicó cuatro veces en tiempo. Se utilizó la técnica de cultivo en tubos roll y bajo condiciones de anaerobiosis estricta. La siembra de bacterias viables totales, celulolíticas, metanogénicas y los hongos anaeróbicos se efectuaron en medios de cultivo selectivos (PNO 1-4). Se utilizó una mezcla de hidrógeno y dióxido de carbono (60:40) en la fase gaseosa. Los protozoos se contaron al microscopio óptico en cámara de Neubauer. Para ello los protozoos se tiñeron con una solución de violeta genciana al 0,01% en ácido acético glacial al 1%. El análisis estadístico se realizó de acuerdo al diseño experimental empleado. Para comparar las medias se utilizó la prueba de rango múltiple de Duncan para P<0,05 en los casos necesarios. RESULTADOS No se encontró interacción significativa entre las proporciones de L. leucocephala y las horas de fermentación in vitro. El empleo de la relación pasto estrella:modulador con leucaena (80:20) incrementó la población de bacterias viables totales. Los niveles de inclusión de 25 y 30% no modificaron este indicador (Cuadro 1). En general, se encontró un incremento de los celulolíticos por efecto de la inclusión de L. leucocephala comparado con el tratamiento control obteniendo las mejores respuestas en las relaciones 80:20 y 70:30. No resulta clara la respuesta que se observó con la relación 75:25, que aún cuando fue superior al control, mantuvo valores intermedios entre los dos niveles mencionados con anterioridad (Cuadro 1). Por su parte, los hongos celulolíticos incrementaron su población cuando se incluyó el modulador en todas las variantes empleadas, sin diferencias entre las mismas. El nivel de inclusión de 20% del modulador (relación 80:20) no produjo modificaciones en la población de bacterias metanogénicas. Sin embargo, valores de inclusión de 25 y 30%, reducen de manera significativa el número total de metanógenos en el rumen. Los valores de las medias de bacterias metanogénicas fueron 40,22 38,42 13,98 y 12,46 x 107 ufc/mL para los tratamientos con 0, 20, 25 y 30% de inclusión del modulador, respectivamente Las poblaciones de protozoos se encontraron entre 0,63 y 2,75 x 105 célula/mL a las 4 h de fermentación in vitro, bajo las condiciones experimentales desarrolladas. En todas las variantes en que se empleó el modulador con L. leucocephala, las poblaciones fueron significativamente más bajas; pero la menor población se encontró cuando se empleó la relación 80:20. El tiempo de fermentación modificó la población de bacterias viables totales, celulolíticas y hongos anaerobios (Cuadro 2). Las bacterias viables totales incrementan su población a partir de las 4 h de fermentación, sin diferencias hasta las 8 h. Las celulolíticas, por su parte, se incrementan notablemente a las 8 h, mientras que los hongos siguen una tendencia similar, excepto que no se encontraron diferencias a las 4 h entre el tiempo antes de iniciar la fermentación (hora 0) y las 8 h. DISCUSIÓN Los resultados obtenidos en este trabajo demuestran que es posible utilizar a L. leucocephala para formular productos moduladores de la fermentación ruminal capaces de reducir la población de metanógenos y modificar la presencia de otros grupos microbianos que habitan en ese complejo ecosistema. Es importante indicar que el empleo del modulador no compromete la microbiota responsable de fermentar la fibra, lo cual coincide con reportes de trabajos anteriormente realizados en Cuba por el colectivo de autores de la actual investigación, los que indicaron la existencia de interrelaciones entre las bacterias celulolíticas y las metanogénicas a nivel del rumen. Al respecto, Galindo et al. (2006) informaron que la fermentación completa de la celulosa hasta productos asimilables por los animales se efectúa por una población mixta integrada por microorganismos celulolíticos puros, especies microbianas que fermentan los glúcidos producidos por la hidrólisis de la celulosa, especies que degradan los compuestos como ácido succínico y ácido fórmico y bacterias metanogénicas. Estas utilizan el hidrógeno metabólico o el formiato para la producción de CH4. La reducción en los metanógenos que propició el modulador con L. leucocephala pudiera colocar a los animales que lo consuman en un balance energético positivo, fundamentalmente, como resultado de menores pérdidas de energía por concepto de metano. Como indicaron Anderson et al. (2003) el metano no solamente es un contaminante ambiental sino que cualquier método que atenúe su producción en rumen tiene una repercusión en el metabolismo energético de los rumiantes. La conversión anaeróbica de materia orgánica a CH4 en el rumen involucra un consorcio de microorganismos donde los metanógenos intervienen en el paso final. Primeramente, las bacterias, hongos y protozoos hidrolizan las proteínas, polisacáridos y lípidos para producir aminoácidos y azúcares, y fermentan estos últimos a ácidos grasos de cadena corta, H2 y CO2. El CH4 se forma entonces por los metanógenos ruminales, usando H2 (80%) y el formiato (18%) como sustratos (Demeyer y Fievez 2000). Un aspecto de gran importancia y que constituye una hipótesis probable acerca de la reducción de la metanogénesis ruminal es la relación de los metanógenos con los protozoos del rumen, ya que los metanógenos que viven en el interior o adheridos a la superficie de los protozoos ciliados del rumen son responsables de más del 37% de las emisiones de metano. En ausencia de protozoos o cuando su población se deprime, las emisiones de metano del rumen se reducen alrededor de 13%. De ahí que el uso de plantas con poder defaunante es una vía real para disminuir los metanógenos, tal y como quedó demostrado. CONCLUSIONES En esta investigación la inclusión de leucaena en fermentadores in vitro fue un agente modulador de la microbiota. Se redujo la población de protozoarios y de los organismos metanogénicos, mejorando la cantidad de los microorganismos digestores de celulosa sin que se afectara la cantidad total de bacterias presentes. De las experiencias in vitro se deduce que este efecto pudiera observarse in vivo en aquellos animales que reciban o pastoreen en bancos de leucaena. AGRADECIMIENTOS Los autores del trabajo desean agradecer a la Organización Internacional de Energía Atómica (OIEA) por el financiamiento de la presente investigación en el marco del Proyecto LITERATURA CITADA
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