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Clonación, Expresión y Purificación de la Troponina I Cardiaca Humana y su Fragmento Aminoterminal en Escherichia coli Mainet, Damián; Sánchez, Leticia; Nazábal, Marcelo; Echevarría, Maydel & Sorell, Luis Resumen En la actualidad, la troponina I cardiaca humana (TnIc) constituye el marcador bioquímico más cardioespecífico del infarto agudo del miocardio. La TnIc presenta una región aminoterminal de 32 aminoácidos adicionales no presentes en su isoforma esquelética, lo que le confiere cardioespecificidad. En este artículo, se describe el aislamiento y la amplificación del gen que codifica la TnIc, a través de la reacción en cadena de la polimerasa acoplada a la transcripción inversa del ARN total purificado a partir de músculo cardiaco. Posteriormente, se realizó la clonación del ADN amplificado en el vector de expresión. El fragmento aminoterminal cardioespecífico fue clonado de forma independiente en el mismo vector de expresión. En ambos casos, se obtuvieron niveles de expresión elevados de 43% y 30% en Escherichia coli, respectivamente. Estas moléculas se expresaron en su mayor parte como proteínas insolubles. Se purificaron por electroelución en geles de poliacrilamida y se obtuvieron rendimientos de 41 mg de TnIc recombinante y 23 mg del fragmento aminoterminal recombinante de la TnIc por litro de cultivo de E.coli. La pureza de ambas proteínas recombinantes varió entre 92% y 94%. Las dos variantes de las moléculas recombinantes, mostraron propiedades antigénicas similares a las de la TnIc natural mediante ultramicroELISA. Por esta razón, estas moléculas podrían constituir inmunógenos apropiados para obtener anticuerpos monoclonales antiTnIc cardioespecíficos, que se emplearían en el diagnóstico del infarto agudo del miocardio. Palabras-clave electroelución, expresión en bacteria, reacción en cadena de la polimerasa, troponina I cardiaca

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Cloning, Expression and Purification of Human Cardiac Troponin I and Its Specific Amino-terminal Fragment in Escherichia coli Mainet, Damián; Sánchez, Leticia; Nazábal, Marcelo; Echevarría, Maydel & Sorell, Luis Abstract The human cardiac troponin I (TnIc) is nowadays the most cardiospecific diagnostic marker for acute myocardial infarction. The cardiac isoform of troponin I contains 32 additional amino acids on the N-terminus, which confer cardiac specificity. This paper describes the isolation of TnIc gen through reverse transcription-polymerase chain reaction using total RNA from cardiac tissue, and its cloning into an expression vector. The cardiospecific aminoterminal fragment of TnIc was cloned into the same expression vector. These molecules were obtained to high levels in Escherichia coli, representing 43% and 30% of total cellular protein, respectively. Both molecules were highly expressed as insoluble proteins. The entire protein and its fragment were purified by electroelution with a 94% and 92% purity, respectively. The yields of recombinant cardiac troponin I and recombinant aminoterminal fragment of TnIc were 41 mgand 23mg per liter of E.coli culture, respectively. The recombinant TnIc and the fragment showed antigenic properties similar to those of the natural TnIc in ultramicroELISA. These molecules are thus good immunogens for obtaining anti-TnIc cardiospecific monoclonal antibodies, which are very important for the development of diagnostic kits for detecting acute myocardial infarction. Keywords bacterial expression, cardiac Troponin I, electroelution, polymerase chain reaction

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