Biotecnología Aplicada 1998;15:167-172
Structural analysis of the 14-3-3 proteins by LC-ESIMS: Characterisation of
seven 14-3-3 isoforms isolated from human placenta
Joel Madrazo, Steven Howell, David Jones, Harry Martin and Alastair
Aitken
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ABSTRACT
The 14-3-3 is a family of acidic dimeric proteins with a pI of about
4.5 and a mass of 30 kDa on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel
electrophoresis. There are seven major mammalian brain isoforms of 14-3-3
proteins, named a to h . 14-3-3 is highly conserved over a wide range of
mammalian species. Homologues of 14-3-3 have also been found in plants,
insects, amphibians and yeast. Here we present the structural analysis of
14-3-3 proteins with femtomole sensitivity by liquid
chromatography-electrospray ionization mass spectrometry (LC-ESIMS). A
reverse phase capillary column was set up for on-line trapping of
peptides/proteins for concentration and desalting. Controlled digestion of
native 14-3-3 with subtilisin was fractionated by gel filtration and
fractions were analysed by ESIMS. It was shown that the N-terminus is an
intact domain involved in the 14-3-3 dimerisation for all isoforms.
Crosslinking experiments of the isolated N-terminal domain confirmed its
dimeric association for all the isoforms isolated from sheep brain. The
characterisation of 14-3-3 isolated from human placenta showed the presence
of six known brain isoforms: t , b , g , e , z and h . A new isoform e * was
found that was recognised by the antiserum specific to the e isoform. It had a molecular mass of 14 Da higher
than e , but lower retention time on
reverse-phase high performance liquid chromatography. Molecular masses of
14-3-3 monomers isolated from human placenta were measured. We found that
a and d , which are
in vivo post-translationally phosphorylated forms of b and z respectively in the
mammalian brain, are absent in the placenta.
Key words: 14-3-3 proteins, human placenta, dimers, protein
domains, controlled digestion, ESIMS, femtomole sensitivity
RESUMEN
Las 14-3-3 constituyen una familia de proteínas
acídicas diméricas con un pI cercano a 4,5 y una masa de 30
kDa en geles de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio. En cerebro de
mamíferos existen siete isoformas mayoritarias de estas
proteínas nombradas a , b , ..., h , las cuales son
altamente conservadas en un amplio espectro de especies de
mamíferos. Se han encontrado también homólogos de las
14-3-3 en plantas, insectos, anfíbios y levaduras. Aquí
presentamos el análisis estructural de las 14-3-3 mediante
espectrometría de masas con ionización por
electronebulización acoplada a cromatografía líquida
(LC-ESIMS) con sensibilidad femtomolar. Una columna capilar de fase inversa
fue empleada en linea para la preconcentración y desalado de los
péptidos y las proteínas analizados. Mediante digestiones
controladas de las 14-3-3 nativas con subtilisina fue posible obtener un
dominio que fue aislado por filtración en gel y analizado por ESIMS.
Se demostró que el extremo NH2 de estas proteínas
es un dominio que está involucrado en la dimerización de
todas las isoformas de las 14-3-3. Los experimentos de entrelazamiento de
este dominio permitieron confirmar su asociación dimérica
para todas las isoformas aisladas de cerebro ovino. La
caracterización de las 14-3-3 aisladas de placenta humana
demostró la presencia de al menos seis de las isoformas de cerebro:
t , b , g , e , z y h . Se encontró
una nueva isoforma e *, la cual es reconocida
por los antisueros específicos para e .
El valor de la masa molecular medido por ESI es 14 Da mayor que esta
última, mientras es menos retenida en la cromatografía de
fase inversa. Se obtuvieron los valores de masas moleculares para las
isoformas aisladas de placenta humana y encontramos que las isoformas a y d , que corresponden a
las formas fosforiladas in vivo de b y
z respectivamente en cerebro de
mamíferos, están ausentes en placenta.
Palabras claves: proteínas 14-3-3, placenta humana,
dímeros, dominios, digestión controlada, ESIMS, sensibilidad
femtomolar
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